Объектами исследования служили генетически маркированные штаммы-продуценты аминокислот, белков и нуклеозидов, полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов:
1. Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652, лейцинзависимый штамм факультативных метилотрофных бактерий, продуцент фенилаланина. TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
2. Methylobacillus flagellatum КТ, изолейцинзависимый штамм облигатных метилотрофных бактерий, продуцент лейцина.
3. Bacillus subtilis В-3157, полиауксотрофный по гистидину, тирозину, аденину и урацилу штамм грамотрицательных бактерий, продуцент инозина.
4. Halobacterium halobium ЕТ 1001, пигментсодержащий штамм галофильных бактерий, способный синтезировать бактериородопсин.
Для приготовления питательных сред и адаптации бактерий использовали 2H2O (99.9% 2H), и 2HСl (95.5% 2H) и [U- 2Н]метанол (97.5% 2H), полученные из Российского научно-исследовательского центра “Изотоп” (Санкт-Петербург, РФ). По необходимости 2H2O очищали от вредных примесей, перегоняя её над перманганатом калия [22].
Стартовым материалом для культивирования галофильных бактерий и бацилл служила (2Н)меченая биомасса метилотрофных бактерий, полученная в условиях многостадийной адаптации на твердых агаризованных средах (2% агар) с 2% [U- 2Н]метанолом, содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды (от 0 до 98% 2Н2О). Полученную таким образом (2Н)меченую биомассу B. methylicum (выход составил 100 г по влажному весу с 1 л. среды) автоклавировали в 0.5 н. растворе 2HСl (в 2H2O) (08 ати, 30 мин), нейтрализовали 0.1 н. КОН (рН 7.0) и использовали далее в качестве источника ростовых факторов для адаптации и культивирования бацилл и галофильных бактерий.
В настоящей работе использовали следующие питательные среды (количества компонентов приведены в г/л):
1. Минимальная среда М9, на основе различных концентраций 2H2O (см. табл. 1 и табл. 2) и добавками 0.5-2% метанола (в зависимости от физиологической потребности бактерий) или [U-2H]метанола: KH2PO4 3; Na2HPO4 6; NaCl 0.5; NH4Cl 1. Среду использовали для культивирования метилотрофных бактерий.
2. Гидролизная среда 1 (ГС1) для культивирования бацилл (на основе 100% 2H2О): глюкоза 120; (2Н)меченая биомасса B. methylicum 25; NH4NO3 30; MgSO4 x 7H2O 20; мел 20.
3. Гидролизная среда 2 (ГС2)
для культивирования галофильных бактерий (на основе 100% 2H2О): NaCl 250; MgSO4 x 7H2O 20; KCl 2; CaCl2 x 6H2O 0.065; цитрат натрия 0.5; (2Н)меченая биомасса B. methylicum 20.
Культивирование метилотрофных бактерий и бацилл проводили при 370 С в колбах Эрленмейера вместимостью 250 мл с наполнением средой до 50 мл в условиях интенсивной аэрации по методикам [14] и [15], используя в качестве источников дейтерия 2H2O и [U-2H]метанол. В случае с галофильными бактериями их культивирование проводили на 2H2O-среде при освещении лампами дневного света ЛБ-40. После 6-7 суток культивирования клетки отделяли центрифугированием (10000 об/мин, 20 мин). В культуральных жидкостях анализировали секретируемые аминокислоты и нуклеозиды.
Для выделения фракции суммарных белков биомассы клетки дважды промывали дистиллированной водой с последующим центрифугированием (10000 об/мин, 20 мин), экспонировали ультразвуком при 22 кГц (3 x 15 мин) и центрифугировали. Липиды и пигменты экстрагировали смесью органических растворителей хлороформ-метанол-ацетон (2:1:1) по методу Блайя и Дайера [23]. Полученный осадок высушивали до постоянного веса (10-12 мг) и использовали его в качестве фракции суммарных белков биомассы.
Суммарные белки биомассы гидролизовали в запаянных стеклянных ампулах в 50-ти кратном избытке 6 н. 2HCl (в 2H2O). Ампулы выдерживали при 1100 в течение 24 ч. После этого реакционную массу суспендировали в горячей дистиллированной воде, фильтровали. Гидролизат упаривали в роторном испарителе при 400 С. Остатки дейтеросоляной кислоты удаляли путем выдерживания в эксикаторе над твердым NaOH.
Для проведения гидролиза внутриклеточных полисахаридов 50 мг сухой делипидизованной биомассы помещали в круглодонную колбу вмесимостью 250 мл, добавляли 50 мл дистиллированной воды и 1.6 мл 25% 2H2SO4 и кипятили с обратным водяным холодильником в течении 90 мин. По охлаждении реакционную смесь суспендировали в одном объёме горячей дистиллированной воды и нейтрализовали 2 н. раствором Ba(ОН)2 до рН 7.0. Выпавший осадок сульфата бария отделяли центрифугированием (15000 об/мин, 5 мин), супернатант декантировали и упаривали в роторном испарителе при 400 С.
Рост бактерий оценивали по способности к образованию отдельных колоний на поверхности твёрдых агаризованных сред, а также по величине оптической плотности суспензии клеток, измеренной на спектрофотометре Beckman-DU6 (США) при 540 нм в кварцевой кювете с длиной оптического пути 10 мм.
Статьи и публикации:
Общие географические сведения
Рельеф Самарской области неоднороден. Река Волга, которая протекает через область с севера на юг, делит ее на две неравные части. Большая часть – Заволжье – лежит в левобережье, меньшая находится в правобережье, называется Предволжье и вк ...
Получение микробных протеиназ
В Номенклатуру и классификацию ферментов внесено большое количество протеолитических ферментов микробного происхождения, которые относятся к различным подподклассам: 3.4.11 (7 ферментов), 3.4.13(5), 3.4.15(1), 3.4.16(1), 3.4.17(5), 3.4.21 ...
Эритроциты. Строение, функции, количество.
Эритроциты возникли в процессе эволюции как клетки, содержащие дыхательные пигменты, которые осуществляют перенос кислорода и диоксида углерода. Зрелые эритроциты у рептилий, амфибий, рыб и птиц имеют ядра. Эритроциты млекопитающих – безъ ...