Биология » Ферменты » ДНК-лигаза

ДНК-лигаза

Получение рекомбинантных молекул ДНК включает объединение in vitro сегментов ДНК из различных источников. Благодаря тому, что при расщеплении ДНК определенными эндонуклеазами образуются фрагменты с липкими концами, при отжиге эти фрагменты довольно легко соединяются, однако водородные связи, удерживающие их вместе, в обычных условиях оказываются относительно слабыми и легко разрушаются. Для ковалентного сшивания фрагментов используют ДНК-лигазу, которая катализирует образование фосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами.

Чтобы лигирование было успешным, в объединяемых цепях должен произойти отжиг комплементарных концов; в этом случае происходит лигирование обеих цепей. Если два одноцепочечных сегмента удерживаются рядом за счет образования водородных связей с интактной комплементарной цепью, то образование фосфодиэфирной связи происходит только в одной цепи. ДНК-лигаза фага Т4 способна также соединить двухцепочечные молекулы с тупыми концами, катализируя образование фосфо-диэфирных связей в обеих цепях.

Цепи удлиняются путем последовательного присоединения нуклеотидов к праймеру со свободной 3'-гид-роксильной группой; выбор нуклеотидного остатка на каждом этапе определяется ДНК-матрицей. ДНК-полимераза I E. coli катализирует и некоторые другие важные реакции. Две из них имеют особое значение для экспериментов с рекомбинантными ДНК: это 3'–>5'- и 5'–>3'-экзонуклеазные реакции. В обоих случаях образуются продукты с 5'-фосфомоноэфирными концами. Две указанные экзонуклеазные активности присущи разным участкам молекулы ДНК-полимеразы I, которые можно разделить, обработав белок протеолитическими ферментами. После разделения обнаруживается, что 3'–>5'-экзонуклеазная и полимеразная активности связаны с большим по размеру полипептидом, содержащим карбоксильную группу на конце, а 5'–>3'-экзонуклеазная активность – со вторым, более мелким фрагментом.

б. Никтрансляция

Реакции, катализируемые ДНК-полимеразой I, нашли широкое применение. Например, часто используется способность ДНК-полимеразы I катализировать одновременно как полимеризацию, так и 5'–>3'-экзонуклеазное расщепление. Фермент, выступая в роли экзонуклеазы, осуществляет деградацию цепи в 5'–>3'-направлении, начиная с 5'-конца одноцепочечной бреши в двухцепочечной ДНК, а выступая в роли полимеразы, восстанавливает цепь путем последовательного присоединения мононуклеотидных остатков к свободной 3'-гидроксильной группе на другом конце бреши. Собственно синтеза ДНК не происходит: брешь лишь перемещается вдоль цепи, чем и объясняется название этого процесса – никтрансляция. Проводя никтрансляцию в присутствии а-32Р-меченных дезоксинуклеозидтрифосфатов, в качестве субстратов получают меченые фрагменты ДНК с высокой удельной активностью.

в. Заполнение брешей

ДНК-полимераза способна превращать фрагменты ДНК с липкими концами во фрагменты с тупыми концами при наличии выступающего 5'-конца. 3'-гидроксильный конец служит праймером, 5'-выступ – матрицей; пробел на 3'-конце заполняется путем последовательного присоединения дезоксинуклеотидных остатков. Для заполнения лучше использовать большой карбоксиконцевой фрагмент ДНК-полимеразы I, получаемый в результате протеолиза; это позволяет избежать 5'–>3'-экзонуклеазного расщепления матрицы. Липкие концы можно превратить в тупые и с помощью специфичной к одноцепочечной ДНК нуклеазы, однако в этом случае утрачивается несколько нуклеотидных остатков.

Статьи и публикации:

Отдел механизации
Отдел разрабатывает систему машин для создания и содержания защитных насаждений. Проводят теоретические и экспериментальные исследования рабочих органов и последующую разработку конструкции и изготовление опытных образцов технических сред ...

Стандартизация ферментных препаратов
Очень часто ферментативная активность партии готового препарата заметно отличается от предыдущих. Потребитель же должен получать препарат с определенной стандартной активностью. Поэтому на основе длительного анализа практической работы пр ...

Комбинативная изменчивость
Комбинативная наследственная изменчивость возникает в результате обмена гомологичными участками гомологичных хромосом в процессе мейоза, а также как следствие независимого расхождения хромосом при мейозе и случайного их сочетания при скре ...

Разделы