Получение рекомбинантных молекул ДНК включает объединение in vitro сегментов ДНК из различных источников. Благодаря тому, что при расщеплении ДНК определенными эндонуклеазами образуются фрагменты с липкими концами, при отжиге эти фрагменты довольно легко соединяются, однако водородные связи, удерживающие их вместе, в обычных условиях оказываются относительно слабыми и легко разрушаются. Для ковалентного сшивания фрагментов используют ДНК-лигазу, которая катализирует образование фосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами.
Чтобы лигирование было успешным, в объединяемых цепях должен произойти отжиг комплементарных концов; в этом случае происходит лигирование обеих цепей. Если два одноцепочечных сегмента удерживаются рядом за счет образования водородных связей с интактной комплементарной цепью, то образование фосфодиэфирной связи происходит только в одной цепи. ДНК-лигаза фага Т4 способна также соединить двухцепочечные молекулы с тупыми концами, катализируя образование фосфо-диэфирных связей в обеих цепях.
Цепи удлиняются путем последовательного присоединения нуклеотидов к праймеру со свободной 3'-гид-роксильной группой; выбор нуклеотидного остатка на каждом этапе определяется ДНК-матрицей. ДНК-полимераза I E. coli катализирует и некоторые другие важные реакции. Две из них имеют особое значение для экспериментов с рекомбинантными ДНК: это 3'–>5'- и 5'–>3'-экзонуклеазные реакции. В обоих случаях образуются продукты с 5'-фосфомоноэфирными концами. Две указанные экзонуклеазные активности присущи разным участкам молекулы ДНК-полимеразы I, которые можно разделить, обработав белок протеолитическими ферментами. После разделения обнаруживается, что 3'–>5'-экзонуклеазная и полимеразная активности связаны с большим по размеру полипептидом, содержащим карбоксильную группу на конце, а 5'–>3'-экзонуклеазная активность – со вторым, более мелким фрагментом.
б. Никтрансляция
Реакции, катализируемые ДНК-полимеразой I, нашли широкое применение. Например, часто используется способность ДНК-полимеразы I катализировать одновременно как полимеризацию, так и 5'–>3'-экзонуклеазное расщепление. Фермент, выступая в роли экзонуклеазы, осуществляет деградацию цепи в 5'–>3'-направлении, начиная с 5'-конца одноцепочечной бреши в двухцепочечной ДНК, а выступая в роли полимеразы, восстанавливает цепь путем последовательного присоединения мононуклеотидных остатков к свободной 3'-гидроксильной группе на другом конце бреши. Собственно синтеза ДНК не происходит: брешь лишь перемещается вдоль цепи, чем и объясняется название этого процесса – никтрансляция. Проводя никтрансляцию в присутствии а-32Р-меченных дезоксинуклеозидтрифосфатов, в качестве субстратов получают меченые фрагменты ДНК с высокой удельной активностью.
в. Заполнение брешей
ДНК-полимераза способна превращать фрагменты ДНК с липкими концами во фрагменты с тупыми концами при наличии выступающего 5'-конца. 3'-гидроксильный конец служит праймером, 5'-выступ – матрицей; пробел на 3'-конце заполняется путем последовательного присоединения дезоксинуклеотидных остатков. Для заполнения лучше использовать большой карбоксиконцевой фрагмент ДНК-полимеразы I, получаемый в результате протеолиза; это позволяет избежать 5'–>3'-экзонуклеазного расщепления матрицы. Липкие концы можно превратить в тупые и с помощью специфичной к одноцепочечной ДНК нуклеазы, однако в этом случае утрачивается несколько нуклеотидных остатков.
Статьи и публикации:
Виды геномики
Геномика дифференцируется по нескольким направлениям:
1) Структурная геномика, задачей которой является идентификация генов с помощью специальных компьютерных программ (ведется поиск открытых рамок считывания со старт и терминирующими ко ...
Сырье, содержащее стероидные алкалоиды (гликоалкалоиды)
Стероидные алкалоиды представляют собой стероидные соединения, в которых сочетаются свойства как алкалоидов, так и стероидных сапонинов. Подобно сапонинам они расщепляются на сахар и агликон сапогенин, но с атомом N при С27. В основе их а ...
Антон Романович Жебрак
Антон Романович Жебрак (белор. Антон Раманавіч Жабрак, 14 (27) декабря 1901 дер. Збляны, ныне Гродненской обл. — 20 мая 1965) — советский генетик и селекционер. Академик АН БССР (1940), президент АН БССР с мая по ноябрь 1947 г. Кавалер ор ...