а. Полимеризация без матрицы
Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза является в определенном смысле полимеразой, поскольку она катализирует синтез полидезоксирибо-нуклеотидов из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов с высвобождением неорганического пирофосфата. Подобно ДНК-полимеразам, она не способна инициировать синтез новой полимерной цепи и поэтому требует присутствия праймера со свободной концевой 3'-гидроксильной группой. Однако в отличие от истинных ДНК-полимераз она не нуждается в матрице и не способна что-либо копировать вообще. Продукт полимеризации соответствует дезокси-нуклеозидтрифосфатам, используемым в качестве субстрата. Если в реакции участвует dATP, то продуктом является полидезоксиадениловая кислота, находящаяся на 3'-конце праймера; если используется dGTP, то к праймеру оказывается присоединенной poly. Поскольку терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза не копирует матрицу, продуктом синтеза является одноцепочечный полимер. При использовании в качестве праймера двухцепочечной молекулы на каждом конце дуплекса образуются одинаковые 3'-хвосты. На самом деле терминальная дезоксинуклеоти-дилтрансфераза предпочитает одноцепочечные, а не двухцепочечные праймеры. Если имеется полностью двухцепочечный фрагмент ДНК, к которому нужно присоединить одноцепочечные хвосты, можно использовать различные методы получения одноцепочечных концов, способных служить праймерами.
б. Синтез липких концов
С помощью дезоксинуклеотидилтрансферазы к молекулам ДНК, не имеющим липких концов, можно присоединить такие концы. Тупые концы образуются при механическом разрыве больших молекул ДНК, при обработке ДНК с помощью рестриктирующих эндонуклеаз, дающих тупые концы, или при действии неспецифических ДНКаз. Например, если к одному набору фрагментов ДНК присоединить poly, а к другому – poly и смешать эти фрагменты, то произойдет их соединение друг с другом. Пробелы, образующиеся из-за неравной длины poly- и ро1уА) – хвостов, могут быть заполнены с помощью ДНК-полимеразы I, а концы соединены ДНК-лигазой. Такой подход использовался при конструировании первой рекомбинантной молекулы ДНК. И хотя открытие рестриктирующих эндонуклеаз сильно упростило процедуру получения липких концов при рекомбинации молекул ДНК in vitro, иногда для их создания все еще используется терминальная дезоксинуклеотидил-трансфераза.
Статьи и публикации:
Основные направления и
цели медико-биологического использования лазеров.
Современные направления медико-биологического применения лазеров могут быть разделены на две основные группы :
В нижней половине схемы сгруппированы направления использования лазерного излучения в качестве инструмента исследования. ...
Общая характеристика интеллектуального поведения
животных
"Развитие научных идей и взглядов совершается диалектически. Противоположные точки зрения на один и тот же предмет сменяют друг друга в процессе развития научного знания, и новая теория часто является не прямым продолжением предшеств ...
Популяционная структура вида
Вид представляет собой в действительности гораздо более сложную систему, чем просто совокупность скрещивающихся сходных друг с другом особей. Внутри вида существует сложная иерархическая система территориальных популяций, которая является ...