а. Полимеризация без матрицы
Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза является в определенном смысле полимеразой, поскольку она катализирует синтез полидезоксирибо-нуклеотидов из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов с высвобождением неорганического пирофосфата. Подобно ДНК-полимеразам, она не способна инициировать синтез новой полимерной цепи и поэтому требует присутствия праймера со свободной концевой 3'-гидроксильной группой. Однако в отличие от истинных ДНК-полимераз она не нуждается в матрице и не способна что-либо копировать вообще. Продукт полимеризации соответствует дезокси-нуклеозидтрифосфатам, используемым в качестве субстрата. Если в реакции участвует dATP, то продуктом является полидезоксиадениловая кислота, находящаяся на 3'-конце праймера; если используется dGTP, то к праймеру оказывается присоединенной poly. Поскольку терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза не копирует матрицу, продуктом синтеза является одноцепочечный полимер. При использовании в качестве праймера двухцепочечной молекулы на каждом конце дуплекса образуются одинаковые 3'-хвосты. На самом деле терминальная дезоксинуклеоти-дилтрансфераза предпочитает одноцепочечные, а не двухцепочечные праймеры. Если имеется полностью двухцепочечный фрагмент ДНК, к которому нужно присоединить одноцепочечные хвосты, можно использовать различные методы получения одноцепочечных концов, способных служить праймерами.
б. Синтез липких концов
С помощью дезоксинуклеотидилтрансферазы к молекулам ДНК, не имеющим липких концов, можно присоединить такие концы. Тупые концы образуются при механическом разрыве больших молекул ДНК, при обработке ДНК с помощью рестриктирующих эндонуклеаз, дающих тупые концы, или при действии неспецифических ДНКаз. Например, если к одному набору фрагментов ДНК присоединить poly, а к другому – poly и смешать эти фрагменты, то произойдет их соединение друг с другом. Пробелы, образующиеся из-за неравной длины poly- и ро1уА) – хвостов, могут быть заполнены с помощью ДНК-полимеразы I, а концы соединены ДНК-лигазой. Такой подход использовался при конструировании первой рекомбинантной молекулы ДНК. И хотя открытие рестриктирующих эндонуклеаз сильно упростило процедуру получения липких концов при рекомбинации молекул ДНК in vitro, иногда для их создания все еще используется терминальная дезоксинуклеотидил-трансфераза.
Статьи и публикации:
Микроэмульсии как растворители для органического синтеза
Использование микроэмульсий в органическом синтезе оказалось чрезвычайно полезным, поскольку они способны солюбилизировать полярные и неполярные компоненты, а также пространственно разделять или концентрировать реагенты. Дальнейшее обсужд ...
Ключ для определения родов и видов отдела Папоротникообразные
Насчитывает 3 рода и 10 видов, распространённых в Северно м полушарии. В Средней России только один род Matteuccia Todaro -- Страусник
с одним видом 1. М. struthiopteris (L) Todaro (Struthiopteris filicastrum All.) - С. обыкновенный
СЕ ...
Формирование внутренних
оболочек Земли в процессе ее геологической эволюции. Основные этапы эволюции
Земли
История Земли по современным представлениям насчитывает примерно 4,6 млрд. лет. Многочисленные результаты исследования земной коры (химический состав и структура горных пород, их распределение по глубине, содержание радиоактивных изотопов ...