Биология » Ферменты биологической мембраны » Изучение активности мембранных ферментов

Изучение активности мембранных ферментов
Страница 1

Каталитическая активность мембранных ферментов часто очень сильно зависит от используемого детергента или фосфолипида. Обычно активность мембранных ферментов измеряют в смеси, содержащей детергент и экзогенно добавленный фосфолипид. Кроме того, ферментный препарат нередко содержит соочищаемые с ним эндогенные липиды. В таких условиях физическое состояние фермента, в частности степень его агрегации, оказывается весьма неопределённым и скорее всего гетерогенным. Часто в одной и той же среде, компоненты которой смешивались в разной последовательности, получают совершенно разные ферментативные активности. Такая зависимость от предыстории препарата являет собой пример гистерезиса и весьма типична для мембранных ферментов. По существу фермент «застревает» в метастабильном состоянии и не может приобрести наиболее стабильную «рабочую конформацию».

После того как мембранный фермент очищен, для изучения его каталитической активности желательно, а часто и необходимо реконструировать его с фосфолипидами. Изучение очищенных и реконструированных ферментов даёт большие преимущества. В частности, в такой системе не протекают различные конкурирующие реакции, присущие биомембранам. Использование реконструированной системы позволяет не только охарактеризовать изолированную систему, но и определить минимальное число компонентов, необходимых для проявления тех или иных биохимических активностей.

Для встраивания мембранного белка в липидную везикулу, прежде всего, необходимо избавиться от находящегося в препарате белка детергента, который, если он присутствует в значительных количествах, дестабилизирует фосфолипидный бислой. Обычно детергент удаляют уже из смеси белка с фосфолипидом, но в некоторых случаях белок очищают от детергента до начала реконструкции. Для удаления детергента используют гель-фильтрацию, диализ или адсорбцию на поверхности шариков из полистирола. Последний способ применяют в первую очередь для удаления тритона Х-100.

Методы реконструкции можно разделить на две группы.

1. Процедуры, при которых белок предварительно очищают от детергента, а затем проводят реконструкцию.

2. Процедуры, в которых белки и фосфолипиды смешивают в присутствии детергента, а затем удаляют детергент до образования протеолипосом. Выбранный фосфолипид должен быть способен к формированию стабильных бислоев.

Реконструкция без избытка детергента

1. Инкубация белка с заранее полученными везикулами.

Этот способ используется для реконструкции не пронизывающих бислой белков с ограниченной гидрофобной поверхностью, например цитохрома b5 и в-гидроксибутиратдегидрогеназы.

2. Реконструкция с участием амфифильных катализаторов.

Добавление в белково-фосфолипидную смесь амфифильных веществ в низких концентрациях облегчает встраивание в везикулы таких мембранных ферментов, как бактериородопсин или цитохром с-оксидаза. В качестве амфифильных веществ использовали холестерол, короткоцепочесные фосфатидилхолины и жирные кислоты. Данный способ хорош тем, что в нём не используют какие-либо грубые процедуры, в том числе обработка избытком детергентов, однако пока он мало распространён.

3. Замораживание – оттаивание/обработка ультразвуком.

Эта методика, однако, применяется нечасто из-за опасности денатурации белка. Иногда для облегчения реконструкции используют простую обработку ультразвуком. Вероятнее всего, белок вначале включается в маленькие везикулы, обладающие высокой кривизной. Замораживание – оттаивание, возможно, нужно для слияния мелких протеолипосом в более однородные по размерам.

Реконструкция с использованием детергентов

Страницы: 1 2

Статьи и публикации:

Верхняя боковая поверхность полушария, главные борозды и извилины. Локализация функций связанных с нервной сигнальной системой
Схема. Борозды и извилины верхнелатеральных поверхностей полушарий головного мозга. 1. Латеральная борозда, sulcus lateralis (сильвиева борозда). 2. Покрышечная часть, pars opercularis, лобная покрышка, operculum frontale. 3. Треугольн ...

Характерной особенностью туфельки является раздражимость.
Это способность организма отвечать определенным образом на воздействия окружающей среды. Это свойство характерно для всех живых существ. Раздражитель - фактор среды; раздражение - воздействие раздражителя; раздражимость - ответ организма ...

Причины деления популяций на отдельные социальные ячейки
Возникает вопрос - почему популяция, населяющая биотоп, неизбежно дробится на более мелкие социальные ячейки (стаи, супружеские пары, семьи, включающие множество поколений родственников, и другие)? Здесь есть несколько ответов. Главный из ...

Разделы