Биология » Ферменты биологической мембраны » Изучение активности мембранных ферментов

Изучение активности мембранных ферментов
Страница 1

Каталитическая активность мембранных ферментов часто очень сильно зависит от используемого детергента или фосфолипида. Обычно активность мембранных ферментов измеряют в смеси, содержащей детергент и экзогенно добавленный фосфолипид. Кроме того, ферментный препарат нередко содержит соочищаемые с ним эндогенные липиды. В таких условиях физическое состояние фермента, в частности степень его агрегации, оказывается весьма неопределённым и скорее всего гетерогенным. Часто в одной и той же среде, компоненты которой смешивались в разной последовательности, получают совершенно разные ферментативные активности. Такая зависимость от предыстории препарата являет собой пример гистерезиса и весьма типична для мембранных ферментов. По существу фермент «застревает» в метастабильном состоянии и не может приобрести наиболее стабильную «рабочую конформацию».

После того как мембранный фермент очищен, для изучения его каталитической активности желательно, а часто и необходимо реконструировать его с фосфолипидами. Изучение очищенных и реконструированных ферментов даёт большие преимущества. В частности, в такой системе не протекают различные конкурирующие реакции, присущие биомембранам. Использование реконструированной системы позволяет не только охарактеризовать изолированную систему, но и определить минимальное число компонентов, необходимых для проявления тех или иных биохимических активностей.

Для встраивания мембранного белка в липидную везикулу, прежде всего, необходимо избавиться от находящегося в препарате белка детергента, который, если он присутствует в значительных количествах, дестабилизирует фосфолипидный бислой. Обычно детергент удаляют уже из смеси белка с фосфолипидом, но в некоторых случаях белок очищают от детергента до начала реконструкции. Для удаления детергента используют гель-фильтрацию, диализ или адсорбцию на поверхности шариков из полистирола. Последний способ применяют в первую очередь для удаления тритона Х-100.

Методы реконструкции можно разделить на две группы.

1. Процедуры, при которых белок предварительно очищают от детергента, а затем проводят реконструкцию.

2. Процедуры, в которых белки и фосфолипиды смешивают в присутствии детергента, а затем удаляют детергент до образования протеолипосом. Выбранный фосфолипид должен быть способен к формированию стабильных бислоев.

Реконструкция без избытка детергента

1. Инкубация белка с заранее полученными везикулами.

Этот способ используется для реконструкции не пронизывающих бислой белков с ограниченной гидрофобной поверхностью, например цитохрома b5 и в-гидроксибутиратдегидрогеназы.

2. Реконструкция с участием амфифильных катализаторов.

Добавление в белково-фосфолипидную смесь амфифильных веществ в низких концентрациях облегчает встраивание в везикулы таких мембранных ферментов, как бактериородопсин или цитохром с-оксидаза. В качестве амфифильных веществ использовали холестерол, короткоцепочесные фосфатидилхолины и жирные кислоты. Данный способ хорош тем, что в нём не используют какие-либо грубые процедуры, в том числе обработка избытком детергентов, однако пока он мало распространён.

3. Замораживание – оттаивание/обработка ультразвуком.

Эта методика, однако, применяется нечасто из-за опасности денатурации белка. Иногда для облегчения реконструкции используют простую обработку ультразвуком. Вероятнее всего, белок вначале включается в маленькие везикулы, обладающие высокой кривизной. Замораживание – оттаивание, возможно, нужно для слияния мелких протеолипосом в более однородные по размерам.

Реконструкция с использованием детергентов

Страницы: 1 2

Статьи и публикации:

Основные определения
Регуляцией метаболизма называется управление скоростью биохимических процессов путем обратимого изменения количества белковых посредников, участвующих в этих процессах, или их активности. Белковый посредник – более общий и точный термин, ...

Различные типы чешуи
У многих рыб на коже хорошо развиты слизистые железы, их выделения уменьшают силу сопротивления встречному потоку воды. У некоторых глубоководных рыб на коже развиваются органы свечения, служащие для опознавания своего вида, консолидации ...

Архантропы
Иногда всех гоминин объединяют в один род Homo, к которому принадлежит и современный человек. Однако, отличие наиболее древних представителей подсемейства - архантропов - от современного человека настолько разительно, что многие антрополо ...

Разделы