В настоящее время для реконструкции используют методики, состоящие в солюбилизации смеси белка и фосфолипида детергентом и последующем удалении детергента. После его удаления белок и фосфолипид спонтанно формируют однослойные везикулы, вполне пригодные для энзимологических исследований. Обычно выбирают детергенты с высокой критической концентрацией мицеллообразования и малыми размерами мицелл, с тем, чтобы их можно было легко удалить диализом или гель-фильтрацией. Чаще всего используют холат натрия и октилглюкозид. В качестве примеров можно привести встраивание цитохром с-оксидазы и Na+/K+-ATPазы.
С помощью такой методики можно ввести в везикулы отличные от фосфолипидов вещества, например холестерол или убихинон. В ряде случаев возникает необходимость в достаточно быстром удалении детергента, особенно если белок нестабилен при его избытке. Тогда применяют гель-фильтрационную хроматографию, тоже позволяющую эффективно отделить белково-липидные везикулы от детергента (например, при реконструкции глицеро-3-фосфатацилтрансферазы и фосфатидилинозитолсинтазы)
Ещё более быстрым является метод разведения, когда белково-липидно-детергентную смесь разводят до концентрации детергента много меньшей, чем критическая концентрация мицеллообразования. При этом спонтанно образуются белково-фосфолипидные везикулы, которые можно отделить от детергента центрифугированием.
Обычно используемый для отчистки мембранных ферментов тритон Х-100 весьма неудобен при реконструкции, поскольку его трудно удалить из системы. Для удаления тритона применяют шарики из полистирола, и одна из проблем – потеря белка из-за его сорбции на поверхности шариков. В качестве примера белка, реконструируемого этим методом, можно привести натриевый канал.
И наконец, для реконструкции применяли метод, основанный на диспергировании смеси холестерол-фосфолипид-белок в диэтиловом эфире и последующем испарении обращённой фазы.
Статьи и публикации:
Выбор растворителя
Органический растворитель, используемый для микроэмульсионной композиции, должен быть неполярным. По-видимому, гидрофобность растворителя является ключевым фактором, определяющим активность фермента. Установлена хорошая корреляция между г ...
Динамический стереотип, механизм его образования и возрастные
особенности
Динамический стереотип– это система условных и безусловных рефлексов, представляющая собою единый функциональный комплекс. Иначе говоря, динамический стереотип – это относительно устойчивая и продолжительная система временных связей, обра ...
Можжевельник казацкий
Родина - горы Средней и Южной Европы, Сибирь, Кавказ, Малая Азия. Двудомный стелющийся кустарник высотой 1-1,5 м. Быстро разрастается в ширину и образует плотные заросли. Реже встречаются небольшие деревья до 4 м высотой с изогнутыми ство ...