В настоящее время для реконструкции используют методики, состоящие в солюбилизации смеси белка и фосфолипида детергентом и последующем удалении детергента. После его удаления белок и фосфолипид спонтанно формируют однослойные везикулы, вполне пригодные для энзимологических исследований. Обычно выбирают детергенты с высокой критической концентрацией мицеллообразования и малыми размерами мицелл, с тем, чтобы их можно было легко удалить диализом или гель-фильтрацией. Чаще всего используют холат натрия и октилглюкозид. В качестве примеров можно привести встраивание цитохром с-оксидазы и Na+/K+-ATPазы.
С помощью такой методики можно ввести в везикулы отличные от фосфолипидов вещества, например холестерол или убихинон. В ряде случаев возникает необходимость в достаточно быстром удалении детергента, особенно если белок нестабилен при его избытке. Тогда применяют гель-фильтрационную хроматографию, тоже позволяющую эффективно отделить белково-липидные везикулы от детергента (например, при реконструкции глицеро-3-фосфатацилтрансферазы и фосфатидилинозитолсинтазы)
Ещё более быстрым является метод разведения, когда белково-липидно-детергентную смесь разводят до концентрации детергента много меньшей, чем критическая концентрация мицеллообразования. При этом спонтанно образуются белково-фосфолипидные везикулы, которые можно отделить от детергента центрифугированием.
Обычно используемый для отчистки мембранных ферментов тритон Х-100 весьма неудобен при реконструкции, поскольку его трудно удалить из системы. Для удаления тритона применяют шарики из полистирола, и одна из проблем – потеря белка из-за его сорбции на поверхности шариков. В качестве примера белка, реконструируемого этим методом, можно привести натриевый канал.
И наконец, для реконструкции применяли метод, основанный на диспергировании смеси холестерол-фосфолипид-белок в диэтиловом эфире и последующем испарении обращённой фазы.
Статьи и публикации:
Функциональное значение отделов ствола головного мозга
Головной мозг находится в мозговом отделе черепа, который защищает его от механических повреждений. Снаружи мозг покрыт тремя мозговыми оболочками. Масса мозга у взрослого человека обычно составляет около 1400—1600 г (у новорожденных его ...
Генетика пола
Хорошо известно, что у раздельнополых организмов (в том числе и у человека) соотношение полов обычно составляет 1:1. Какие причины определяют пол развивающегося организма? Вопрос этот издавна интересовал человечество ввиду его большого те ...
Емкость в кабеле
Каково влияние постоянной времени на ток в кабеле? Как и в случае простой RC-цепочки (рис. 1С), нарастание и спад потенциала в ответ на скачкообразное изменение тока замедляется благодаря наличию конденсатора. Ситуация осложняется тем, чт ...