В настоящее время для реконструкции используют методики, состоящие в солюбилизации смеси белка и фосфолипида детергентом и последующем удалении детергента. После его удаления белок и фосфолипид спонтанно формируют однослойные везикулы, вполне пригодные для энзимологических исследований. Обычно выбирают детергенты с высокой критической концентрацией мицеллообразования и малыми размерами мицелл, с тем, чтобы их можно было легко удалить диализом или гель-фильтрацией. Чаще всего используют холат натрия и октилглюкозид. В качестве примеров можно привести встраивание цитохром с-оксидазы и Na+/K+-ATPазы. TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
С помощью такой методики можно ввести в везикулы отличные от фосфолипидов вещества, например холестерол или убихинон. В ряде случаев возникает необходимость в достаточно быстром удалении детергента, особенно если белок нестабилен при его избытке. Тогда применяют гель-фильтрационную хроматографию, тоже позволяющую эффективно отделить белково-липидные везикулы от детергента (например, при реконструкции глицеро-3-фосфатацилтрансферазы и фосфатидилинозитолсинтазы)
Ещё более быстрым является метод разведения, когда белково-липидно-детергентную смесь разводят до концентрации детергента много меньшей, чем критическая концентрация мицеллообразования. При этом спонтанно образуются белково-фосфолипидные везикулы, которые можно отделить от детергента центрифугированием.
Обычно используемый для отчистки мембранных ферментов тритон Х-100 весьма неудобен при реконструкции, поскольку его трудно удалить из системы. Для удаления тритона применяют шарики из полистирола, и одна из проблем – потеря белка из-за его сорбции на поверхности шариков. В качестве примера белка, реконструируемого этим методом, можно привести натриевый канал.
И наконец, для реконструкции применяли метод, основанный на диспергировании смеси холестерол-фосфолипид-белок в диэтиловом эфире и последующем испарении обращённой фазы.
Статьи и публикации:
Бактерии. Грибы. Лишайники
БАКТЕРИИ
Строение.
Бактерии - очень мелкие живые организмы. Их можно видеть только под микроскопом с очень сильным увеличением. Все бактерии одноклеточные. Внутреннее строение клетки бактерий не похоже на клетки растений и животных. У н ...
Размножение и развитие
Половой зрелости окуни достигают рано: самцы – в 1-2 года, самки – в 3года и позже. Самцы становятся половозрелыми примерно на год раньше самок (Москул Г.А., Москул Н.Г., 2007).
Время нереста окуня различно, смотря по широте местности. В ...
Эритроциты. Строение, функции, количество.
Эритроциты возникли в процессе эволюции как клетки, содержащие дыхательные пигменты, которые осуществляют перенос кислорода и диоксида углерода. Зрелые эритроциты у рептилий, амфибий, рыб и птиц имеют ядра. Эритроциты млекопитающих – безъ ...