Ретинальсодержащий белок (хромофор - протонированный альдемин ретиналя с e-аминогруппой Lys-216) - бактериородопсин (БR) выполняет функции АТФ-зависимой транслоказы в клеточной мембране галофильных бактерий Halobacterium halobium [1]. Несмотря на его структурно-функциональную изученность, он остается в центре внимания биотехнологии из-за своей высокой светочувствительности и разрешающей способности и используется в прикладных целях как биологический фотохромный материал [2]. БR также привлекателен, как модельный объект для изучения функциональной активности и структурных свойств мембранных белков в составе искусственно сконструированных энергопреобразующих мембран [3].
Для целого ряда структурно-функциональных исследований с БР целесообразно вводить в молекулу белка изотопную метку дейтерия, позволяющую использовать для последующего анализа изотопного включения метод высокочувствительной масс-спектрометрии электронного удара [4, 5]. Поэтому большое научно-прикладное значение имеет БR, меченный дейтерием по остаткам функционально важных ароматических аминокислот - фенилаланина, тирозина и триптофана, участвующих в гидрофобном взаимодействии полипептидной цепи белка с липидным бислоем клеточной мембраны [6]. 2Н-меченые ароматические аминокислоты могут быть синтезированы с препаративными выходами методом обратного изотопного обмена (1Н-2Н) в молекулах протонированных аминокислот - [2, 3, 4, 5, 6-2Н5]фенилаланин в 85% 2H2SO4 при 500C, [3, 5-2H2]тирозин в 6 н. 2H2SO4 при слабом кипячении реакционной смеси, [2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофан в 75% 2H-меченой трифторуксусной кислоте при 250С [7, 8]. Однако несмотря на изученность современных методов химического синтеза 2Н-меченых ароматических аминокислот, отечественная индустрия индивидуальных 2Н-меченых мембранных белков не получила необходимого развития.
В настоящей работе осуществлен биосинтез БР, меченного дейтерием по остаткам [2, 3, 4, 5, 6-2Н5]фенилаланина, [3, 5-2H2]тирозина и [2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофана для реконструкции искусственных мембран с последующим микропрепаративным выделением, а также исследован уровень дейтерированности молекулы БР методом масс-спектрометрии электронного удара метиловых эфиров N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных (Днс)-производных аминокислот с обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выбор стратегии биосинтеза 2Н-меченого БР c использованием штамма экстремальной галофильной бактерии Halobacterium halobium определялся целью исследования, связанной с изучением принципиальной возможности получения 2Н-меченых препаратов мембранного белка в микропрепаративном количестве для реконструкции искусственных мембран. При выборе [2, 3, 4, 5, 6-2Н5]фенилаланина, [3, 5-2H2]тирозина и [2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофана в качестве источников дейтерия учитывалась их исключительная важность в гидрофобном взаимодействии молекулы БР с лилипидным бислоем клеточной мембраны, устойчивость к реакциям (1H-2H) обмена в водной среде в условиях выращивания штамма-продуцента, а также возможность применения метода высокочувствительной масс-спектрометрии электронного удара для последующего анализа. В оптимальных условиях выращивания штамма H halobium (синтетическая среда с 4.3 М NaCl, период инкубации 3-4 сут, 35-370С при освещении монохромным светом с 560 нм) в клетке синтезировался каротиноидсодержащий фиолетовый пигмент, по спектральному соотношению белкового и хромофорного фрагментов молекулы D280/D568 1.5:1 идентичный нативному БР. Как показали результаты исследования, рост штамма на синтетической среде (рис. 1, б) ингибировался незначительно по сравнению с контролем (а) на протонированной среде, что существенно упрощает оптимизацию условий биосинтеза 2Н-меченого БР, заключающуюся в эквивалентной замене протонированных ароматических аминокислот среды их дейтерированными аналогами - [2, 3, 4, 5, 6-2Н5]фенилаланином (0.26 г/л), [3, 5-2H2]тирозином (0.2 г/л) и [2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофаном (0.5 г/л).
Статьи и публикации:
Измерения проводимости
То, что до сих пор обсуждалось, было предложено Ходжкином, Хаксли и Катцем и детально разработано Ходжкином и Хаксли, которые поставили элегантные опыты на гигантском аксоне кальмара. Они экспериментально показали, что при потенциале дейс ...
Адгезионные или сложные межклеточные контакты
Сложные или адгезионные межклеточные соединения представляют собой небольшие парные специализированные участки плазматических мембран двух соседних клеток. Они подразделяются на запирающие (изолирующие), сцепляющие (заякоривающие) и комму ...
Передача генетического материала посредством трансдукции
Трансдукция - передача генетического материала от одной бактерии (донора) другой (реципиенту) с помощью умеренных бактериофагов. Открыта в 1952 Дж. Ледербергом и Н. Циндером при анализе причин изменения наследств, признаков у некоторых шт ...