Биология » Методи исследования клеток » Фракционирование клеточного содержимого

Фракционирование клеточного содержимого
Страница 1

При осторожном применении методов разрушения некоторые органеллы сохраняются в интактном состоянии (ядра, минтохондрии, апарат Гольджи, лизосомы

и пероксисомы). Таким образом, суспензия клеток превращается в растворимый экстракт, содержащий довольно грубую суспензию связанных с мембраною частиц, обладающих характерными размерами, зарядом и плотностью.

После того как в начале 40-х годов начали использовать препаративную центрифугу, разделение различных компонентов гомогената стало вполне реальным. Такая обработка делит клеточные компоненты по их размеру: более крупные частицы при центрифугировании движутся быстрее. Крупные компоненты экстракта, в том числе ядра или неразрушенные клетки, быстро оседают при относительно низких скоростях и образуют осадок на дне центрифужной пробирки.

Ультрацентрифуга разделяет клеточные компоненты не только по массе, но и по плавучей плотности. В этом случае образец седиментирует в круговом градиенте, образованном высококонцентрированным раствором сахарозы или хлористого цезия. Компоненты клеток опускаются по градиенту до тех пор, пока не достигнут участка, плотность раствора в котором равна собственной плотности компонентов. Дальнейшей седиментации компонентов не происходит и они "застревают" на этом уровне. Таким образом, в центрифужной пробирке возникает набор различных полос, причем полосы прилежащие к дну пробирки, содержат компоненты максимальной плавучей плотности. Данный метод настолько чувствителен, что с его помощью можно отделять немеченые макромолекулы от макромолекул, содержащих тяжелые изотопы (13С или 15N).

Фракционированные клеточные экстракты, называемые также бесклеточными системами, широко используются для изучения внутриклеточных процессов. Только работая с бесклеточными экстрактами можно установить молекулярный механизм биологических процессов, поскольку лишь в этом случае исследуемых механизм может быть изучен в чистом виде без помех, создаваемых происходящими в клетке побочными реакциями. Использование бесклеточных систем принесло первый триумфальный успех при изучении механизмов биосинтеза белка. Отправной точкой в данном случае послужил неочищенный клеточный экстракт, способный транслировать молекулы РНК в белок. После многократного фракционирования этого экстракта были получены рибосомы, РНК и различные ферменты, составляющие в совокупности аппарат биосинтеза белка. После получения отдельных компонентов в чистом виде их можно было добавлять в систему и исключать из нее и таким образом уточнять роль каждого компонента в процессе биосинтеза белка. Эта же "система трансляции in vitro" оказалась полезной для расшифровки генетического кода-с использованием в качестве матричной РНК (мРНК) искусственных полинуклеотидов известного состава.

В настоящее время различные системы трансляции in vitro применяют и для определения механизмов распределения белков по различным внутриклеточным компартментам, а также для идентификации белков, кодируемых очищенными препаратами мРНК (очистка мРНК является важным этапом в процедуре клонирования генов).

Многое из того, что мы знаем о молекулярной биологии клетки, открыто при изучении бесклеточных систем. Именно так удалось выяснить механизмы репликации ДНК, транскрипции ДНК, сплайсинга РНК, мышечного сокращения и транспорта частиц по микротрубочкам. Анализ в бесклеточных системах подразумевает полное разделение всех составляющих ее индивидуальных макромолекулярных компонентов и, в частности всех белков, входящих в систему. Методы разделения белков рассматриваются в последующих разделах.

В настоящее время хроматография является одним из методов, наиболее широко используемых для фракционирования белков. Наибольшее распространение получила распределительная хроматография.

Белки чаще всего разделяют методом хроматографии на колонках (колоночная хроматография). В этом случае смесь молекул в растворе пропускают через колонку, содержащую твердый пористый матрикс. В результате взаимодействия с матриксом различные белки проходят через колонку с различной скоростью. После того как разные белки достигнут в определенной последовательности дна колонки, их собирают отдельными фракциями. В настоящее время разработано и применяется множество матриксов различных типов, используя, которые можно делить белки согласно их заряду (ионообменная хроматография), гидрофобности (гидрофобная хроматография), размеру (хроматография гель-фильтрацией) или способности связываться различными химическими группами (аффинная хроматография).

На каждом, этапе колоночной хроматографии содержание белка в смеси увеличивается не более чем в 20 раз, и поэтому выделить из сложной смеси белков отдельный белок за один цикл практически невозможно. На долю каждого белка, как правило, приходится менее 1/1000 всего белка клетки, и для его очистки требуется последовательное использование нескольких различных типов колонок.

Страницы: 1 2 3 4

Статьи и публикации:

Внутреннее строение рыб: нервная система и органы чувств, ч.2
Осязание хорошо развито у большинства рыб, особенно это касается многих донных рыб, а также обитателей мутной воды. Усики рыб есть не что иное, как их органы осязания. Ими они ощупывают различные предметы и животных, находят пищу, ориенти ...

Фосфомоноэстеразы
Часто при проведении экспериментов с рекомбинантными ДНК или при анализе структуры ДНК приходится отщеплять концевые фосфомоноэфирные группы. Известно множество неспецифических фосфомоноэстераз. Эти ферменты, выделенные из клеток Е. coli ...

Понятие о доминантах и недоминантах (ассектаторах). Типология (классификация) доминантов
Каждый конкретный биоценоз характеризуется строго определенным видовым составом. При этом одни виды биоценоза могут быть представлены многочисленными популяциями, а другие малочисленными. В связи с этим в любом биоценозе можно выделить од ...

Разделы