Способы получения ГМ микроорганизмов
Страница 1

Способность организмов синтезировать те или иные биомолекулы, в первую очередь белки, закодирована в их геноме. Поэтому достаточно «добавить» нужный ген, взятый из другого организма, в бактерию, которая способна расти в простых условиях и чрезвычайно быстро размножаться. Но попытки провести перенос в бактерии непосредственно геномной ДНК привели к противоречивым результатам.

Только в 70-е годы были получены воспроизводимые результаты с применением так называемой векторной трансформации. В основе этого подхода лежит использование векторных молекул – ДНК, способных переносить содержащиеся в них гены в клетку, где эти молекулы реплицируются автономно или после интеграции с геномом. Решающую роль в этих экспериментах сыграли также методы получения индивидуальных генов, наработка их в необходимом количестве путем клонирования, то есть практически неограниченного размножения в бактериальных клетках.

В основе всех достижений генетической инженерии лежит одна из особенностей строения генома бактерий – наличие у них небольших, отличных от хромосомы, кольцевых молекул ДНК, называемых плазмидами.

Плазмиды широко распространены в природе и встречаются у подавляющего числа прокариотических организмов, а также у низших эукариот –дрожжей. Важным свойством плазмид является их способность реплицироваться (размножаться) вместе с ДНК клетки хозяина, и поэтому в последнее время их считают внутриклеточными паразитами или симбионтами. Клетки хозяина не нуждаются в плазмидах для выживания в обычных условиях, но часто плазмиды придают им ряд особых свойств. Плазмиды придают бактериям способность к половому размножению (F-фактор), устойчивость к антибиотикам и дезинфицирующим средствам (R-фактор), возможности усвоения некоторых сложных органических веществ, например, углеводородов.

Основная масса исследований, которые привели к развитию генной инженерии, проводилась на классическом объекте микробиологов – кишечной палочке Escherichia coli. С помощью специальных ферментов – эндонуклеаз рестрикции, или рестриктаз, плазмида, несущая какой-нибудь маркерный ген, например, ген устойчивости к определенному антибиотику, разрезается в строго определенном месте с образованием с каждой стороны нескольких (от одного до пяти) неспаренных оснований – «липких концов». С помощью таких же рестриктаз получается фрагмент генома организма-донора, несущий нужный ген, например, ген человеческого инсулина. В последнее время донорную ДНК чаще получают путем «пришивания» «липких концов» к молекуле ДНК, полученной путем обратной транскрипции с матричной РНК нужного гена (кДНК). Главную роль здесь играет фермент обратная транскриптаза, или ревертаза, впервые открытая у ретровирусов (таких как ВИЧ и некоторые возбудители злокачественных новообразований – онковирусов). Далее за счет комплиментарного взаимодействия неспаренных оснований «липких концов» происходит включение нужного гена в плазмиду, при этом образуется новая рекомбинантная (гибридная) ДНК. Завершает процесс фермент ДНК-лигаза, которая ковалентно зашивает разрывы в цепях ДНК.

Следующий этап – перенос рекомбинантной плазмиды в бактерию.

Такой процесс – включение чужеродной ДНК в бактериальную клетку носит название трансформации, а молекула ДНК – вектор. Это явление иногда встречается в природе, что говорит о том, что трансформация – это естественный биологический процесс. В естественных условиях трансформация встречается у таких бактерий, как возбудитель пневмонии.

Другой способ построения векторных молекул использует бактериофаги – особую группу вирусов, заражающих исключительно бактерии. Наиболее широкое применение получил бактериофаг. Средняя часть генома этого вируса не несет в себе важных функций и может быть заменена на чужеродный фрагмент ДНК. В настоящее время существует очень много векторов, сконструированных на основе различных плазмид и бактериофагов.

Значительно сложнее подвергнуть генетической модификации эукариотические микроорганизмы, к которым относятся грибы, протисты, растения и животные. Как и у бактерий, у них имеются плазмиды, но использование их в качестве векторов часто оказывается не очень эффективно. Поэтому для того, чтобы возник стабильный трансформант, необходимы два последовательных события: проникновение рекомбинантной ДНК в клетку и ее интеграция в хромосомную ДНК. Такой метод называется интегративной трансформацией. В дальнейшем генно-инженерное конструирование у дрожжей пошло по пути создания кольцевых плазмид с центромерами, особыми участками ДНК, обеспечивающими связь с белками веретена деления и, следовательно, равномерное распределение таких плазмид между двумя клетками во время митоза. Развитие этого подхода привело к созданию целых искусственных мини-хромосом, содержащих, помимо центромерного участка, теломеры на концах, загнутые в виде шпильки, и репликаторы – участки начала репликации ДНК. Подобные минихромосомы могут включать сразу несколько полезных генов, что обеспечивает производство нужной биотехнологической продукции.

Страницы: 1 2

Статьи и публикации:

Каналы
Под каналами чаще всего понимают ионные каналы, которые, как теперь известно, широко распространены во многих типах клеток. Регулируемые ионные каналы, участвующие в передаче сигнала, в ответ на определенный внешний стимул быстро изменяют ...

Человеческая деятельность и принцип экологической эквивалентности
Человек, воздействуя на экосистемы и отторгая часть вещества и энергии в производственный цикл, нарушает биотические круговороты, что неминуемо сказывается на состоянии окружающей среды. Как правило, она становится неблагоприятной для жиз ...

Глубинное культивирование микроорганизмов
Этот способ имеет ряд очевидных преимуществ перед поверхностным, так как позволяет значительно сократить производственные площади, исключить тяжелый непроизводительный ручной труд, улучшить гигиену труда, упрощает механизацию и автоматиза ...

Разделы