2) систему для узнавания чужеродных генов полимеразами растения –
такой промотор есть в Т-ДНК;
3) маркер, необходимый для селекции трансформированных клеток;
4) уникальные сайты рестрикции, необходимые для введения в конструкцию нужных генов.
Также необходимым условием является отсутствие генов, приводящих к образованию опухоли.
Чаще всего для создания такой генно-инженерной конструкции используют следующий подход. Сегмент Т-ДНК вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в стандартную плазмиду-вектор бактерии Escherichia coli. Рекомбинантная плазмида размножается, и в участок Т-ДНК вставляют нужный ген так же, как и в обычную плазмиду, с использованием рестриктаз. Такой молекулярный гибрид вводят в Agrobacterium tumefaciens, содержащий неизмененную Ti-плазмиду. Благодаря процессу рекомбинации происходит обмен гомологичными участками ДНК рекомбинантной и Ti-плазмид. В результате получится рекомбинантная Ti-плазмида, несущая нужный ген. Последним этапом будет заражение единичных растительных клеток такой Агробактерией и выращивание целого растения, все клетки которого будут экспрессировать нужный ген.
Иногда оказывается проще использовать сразу две рекомбинантные плазмиды. Одна из них содержит только vir-область и является плазмидой-помощницей. Вторая плазмида должна содержать Т-ДНК со встроенным нужным геном. Плазмида-помощница способна переносить в растительную хромосому не только свою Т-ДНК, которой у нее и нет, но и соседнюю. Для облегчения отбора полученных ГМ-растений, рекомбинантная Ti-плазмида несет специальный маркерный ген. В отличие от микроорганизмов, где в качестве маркера используется устойчивость к антибиотикам, в растениях используют особые белки, обладающие способностью светиться в ультрафиолетовом свете. Наиболее часто используют гены люциферазы светлячков и ген GFP медузы (по-английски, «зеленый светящийся белок»).
Помимо технологии, основанной на использовании Ti-плазмиды, в последнее время применяются и другие способы переноса рекомбинантной ДНК в растения. Современный арсенал методов трансформации очень обширен и включает такие подходы, как электропорация клеток (пропускание электрического разряда через смесь опытных клеток и рекомбинантных плазмид, при этом в мембранах клеток возникают бреши, и ДНК проникает в клетку и встраивается в геном), встряхивание смеси клеток, ДНК и микроигл (которые прокалывают мембраны аналогично электрическом току),опосредованная вирусами инфекция, микроинъекции ДНК в клетки. Промышленное применение нашла следующая технология: с помощью специального прибора «Shotgan» осуществляется обстрел растительных тканей мельчайшими пульками из золота или вольфрама, одетыми в молекулы ДНК.
В отдельных случаях оказывается необходимо не ввести какой-нибудь новый ген в растение, а наоборот, заблокировать или ослабить действие природного гена. В качестве примера могут служить плоды томата, которые во время созревания содержат значительное количество специального белка PG, придающего плодам рыхлость. Для устранения этого белка в плоды вводят вектор, содержащий перевернутую копию его гена. В результате транскрипции получается антисмысловая (перевернутая) мРНК, которая комплиментарно связывается с нормальной мРНК. Образуется молекула двухцепочечной РНК, которая уже не может служить матрицей для синтеза белка. В результате получаются томаты с новыми свойствами плодов, которые тверже, дольше хранятся и более устойчивы к грибковым заболеваниям.
Не менее перспективным является направление по генной инженерии не ядерного генома, а генома пластид и митохондрий. В трансгенном материале значительно увеличивается содержание продукта за счет более активных метаболических процессов. Еще множество различных подходов, включая регуляцию активности генов, находятся на стадии разработки.
Статьи и публикации:
Женские половые органы
Женские половые органы, как и мужские, разделяются на внутренние и наружные. К внутренним половым органам, которые расположены в малом тазу, относятся: половая железа – яичник, матка, маточные трубы и влагалище, а к наружным – образова ...
Получение ферментных препаратов
из культур микроорганизмов
Культура микроорганизмов, выращенная поверхностным способом, и культуральная жидкость после глубинного культивирования содержат большое количество балластных веществ. Выделение и очистка ферментов – трудоёмкий и дорогостоящий процесс поэт ...
Понятие о доминантах и недоминантах (ассектаторах). Типология (классификация)
доминантов
Каждый конкретный биоценоз характеризуется строго определенным видовым составом. При этом одни виды биоценоза могут быть представлены многочисленными популяциями, а другие малочисленными. В связи с этим в любом биоценозе можно выделить од ...