БР выделяли
по методу Остерхельта [25], модифицированного нами [24],
солюбилизируя фракцию ПМ (в Н2О) (1 мг/мл) в 1 мл 0.5% ДДС-Na, смесь инкубировали 7-9 ч при 370С с последующим центрифугированием (1200 g, 15 мин). Осадок отделяли, к супернатанту добавляли дробными порциями метанол (3 x 100 мкл) при 00С, выдерживали 14-15 ч при -50С и центрифугировали при охлаждении (1200 g, 15 мин). Фракционирование проводили трижды, уменьшая концентрацию 0.5% ДДС-Na до 0.2 и 0.1%. Кристаллический белок (8-10 мг) промывали холодной дистиллированной водой (2 x 1 мл) и центрифугировали (1200 g, 15 мин). TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
Очистку БР
осуществляли методом гель-проникающей хроматографии на откалиброванной колонке с габаритными размерами 150 x 10 мм; неподвижная фаза - Сефадекс G-200 (Pharmaсia, США) (удельный объем упакованных гранул - 30-40 ед на 1 г сух. сефадекса) с ручным отбором проб. Колонку уравновешивали буферным раствором, содержащим 0.1% ДДС-Na и 2.5 мМ ЭТДА. Пробу белка растворяли в 100 мкл буферного раствора и элюировали 0.09 М Трис-боратным буфером, содержащим 0.5 М NaCl с pH 8.35 (I = 0.075) со скоростью 10 мл/см2 x ч. Объединенные белковые фракции подвергали лиофильной сушке, запаивали в стеклянные ампулы (10 x 50 мм) и хранили в темноте при -40С.
Гидролиз БР.
4 мг белка помещали в стеклянные ампулы размером 10 x 50 мм, добавляли 5 мл 4 н. Ba(OH)2 и выдерживали 24 ч при 1100С. Реакционную смесь суспендировали в 5 мл горячей дистиллированной воды и нейтрализовали 2 н. H2SO4 до рН 7.0. Выпавший осадок сульфата бария отделяли центрифугированием (200 g, 10 мин), супернатант удаляли при 10 мм рт. ст.
N-Днс-производные аминокислот.
К 4 мг сухого гидролизата БR в 1 мл 2 M NaHCO3 (рН 9-10) порциями при перемешивании добавляли 25.6 мг Днс-хлорида в 2 мл ацетона. Реакционную смесь выдерживали 1 ч при перемешивании при 400С, подкисляли 2 н. HCl до рН 3 и экстрагировали этилацетатом (3 x 5 мл). Объединенный экстракт промывали дистиллированной водой до рН 7.0 (2 x 1 мл), сушили безводным сульфатом натрия, растворитель удаляли при 10 мм. рт. ст. Выход 15.3 мг (78%).
Метиловые эфиры N-Днс-производных аминокислот
. Для получения диазометана к 20 мл 40% КОН в 40 мл диэтилового эфира добавляли 3 г влажной N-нитрозометилмочевины и перемешивали 15-20 мин на водяной бане со льдом. После окончания газовыделения эфирный слой отделяли, промывали дистиллированной водой до рН 7.0, сушили безводным сульфатом натрия и использовали для обработки N-Днс-производных аминокислот. Выход 17.4 мг (69%).
L
-[2, 3, 4, 5, 6-2H5]фенилаланин.
40
г фенилаланина растворяли в 300 мл 85% 2Н2SО4 (в 2Н2О) и нагревали с обратным водяным холодильником при 50-600С при перемешивании 3 сут. По окончании реакционную смесь охлаждали, нейтрализовали 30% NH4OН до рН 5.5. Продукт экстрагировали этанолом. Выход 24 г (58.7%). Т пл. 271-273, [a]d25 4.47 (с 1-2, 5 М НСl). рKa 2.20 (СООН), 9.31 (NH2). Rf 0.6 (Г). УФ-спектр (0.1 М НCl): lmax нм (e М-1 см-1): 257.5 (e 195). 1Н-ЯМР: d 3.25 (2H, Hb), 4.4 (1H, Ha), 7.2-7.4 (0.07Н), УД 90 ат.% 2Н. Масс-спектр (M)+ m/z (I, %): 165 (34), метиловый эфир N-Dns-[2, 3, 4, 5, 6-2H5]фенилаланина: 417 (14), 418 (6).
L
-[3, 5-2H2]тирозин.
100 г тирозина растворяли в 150 мл 3 М 2Н2SO4. Реакционную смесь нагревали 2 сут при 40-500С с обратным водяным холодильником в токе азота. По окончании нейтрализовали 28% NH4OH до рН 4.5 и охлаждали 1 сут при 40С. Кристаллический продукт фильтровали, промывали 2Н2О и сушили при 10 мм рт ст. Выход 90 г (86.5%). Т пл. 316 - 317, [a]d25 10.0 (с 2, 5 М НСl). рKa 2.20 (СООН), 9.21 (NH2). Rf 0.45 (Г). УФ-спектр (0.1 М Нcl) lmax нм (e М-1 см-1): 223 (e 8200) и 274.5 (e 1340). 1Н-ЯМР: d 3.32 (2H), d 4.35 (1H), d 6.9 (1H), d 7.2 (2H), УД 96 ат.% 2Н. Масс-спектр (M)+ m/z (I, %): 181 (21), метиловый эфир N-Dns-[3, 5-H2]тирозина: 429 (15), 430 (5).
L
-[2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофан.
К
40 мл 100% 2Н2О добавляли при 40С и перемешивании 80 мл трифторуксусного ангидрида (0.5 моль) и выдерживали 2 ч при 40С, затем дробными порциями добавляли 25 г триптофана. Реакционную смесь выдерживали 3 сут в темноте при 220С, расстворитель удаляли при 10 мм рт., нейтрализовали 30% NH4OH до 5.9, охлаждали 1 сут при 40С. Кристаллический продукт фильтровали, промывали 2Н2О и сушили при 10 мм рт. ст. Выход 19 г (60.3%). Т пл. 283-285, [a]d25 2.8 (с 1-2, 1 М НСl). рKa 2.46 (СООН), 9.41 (NH2). Rf 0.5 (Г). УФ-спектр (0.1 М НCl) lmax нм (e М-1 см-1): 218 (e 33500), 278 нм (e 5550), 287.5 (e 4550). 1Н-ЯМР: d 3.4 (2H, Hb), 4.4 (1H, Ha), 7.3 (1H, He), 7.2-7.4 (0.1Н, In-Н), УД 98 ат.% 2Н. Масс-спектр (M)+ m/z (I, %): 204 (28), метиловый эфир N-Dns-[2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофана: 455 (9), 456 (11).
Статьи и публикации:
Деление растений на травянистые и деревянистые
Кормофиты, к которым относятся описываемые нами растения, состоят из трех основных органов: стебля, листьев и корней.
В зависимости от длины побегов, продолжительности жизни, способа роста и перезимовки, цикла развития их можно разделить ...
Возрастные особенности теплорегуляции организма человека.
Закаливание и его роль в повышении сопротивляемости организма к неблагоприятным
факторам внешней среды
Постоянство температуры тела поддерживается взаимодействием двух процессов: теплообразованием и теплоотдачей.
Теплообразование – процесс образования тепла в результате процессов окисления во всех клетках тканей организма.
Теплоотдача – ...
Фазово-контрастная и интерференционная микроскопия
Возможность потери или нарушения образцов в процессе их приготовления всегда беспокоила микроскопистов. Единственный способ решить эту проблему состоит в изучении живых клеток без фиксации или замораживания. Для этой цели очень полезны ми ...