Экспериментальная часть
Страница 2

БР выделяли

по методу Остерхельта [25], модифицированного нами [24],

солюбилизируя фракцию ПМ (в Н2О) (1 мг/мл) в 1 мл 0.5% ДДС-Na, смесь инкубировали 7-9 ч при 370С с последующим центрифугированием (1200 g, 15 мин). Осадок отделяли, к супернатанту добавляли дробными порциями метанол (3 x 100 мкл) при 00С, выдерживали 14-15 ч при -50С и центрифугировали при охлаждении (1200 g, 15 мин). Фракционирование проводили трижды, уменьшая концентрацию 0.5% ДДС-Na до 0.2 и 0.1%. Кристаллический белок (8-10 мг) промывали холодной дистиллированной водой (2 x 1 мл) и центрифугировали (1200 g, 15 мин).

Очистку БР

осуществляли методом гель-проникающей хроматографии на откалиброванной колонке с габаритными размерами 150 x 10 мм; неподвижная фаза - Сефадекс G-200 (Pharmaсia, США) (удельный объем упакованных гранул - 30-40 ед на 1 г сух. сефадекса) с ручным отбором проб. Колонку уравновешивали буферным раствором, содержащим 0.1% ДДС-Na и 2.5 мМ ЭТДА. Пробу белка растворяли в 100 мкл буферного раствора и элюировали 0.09 М Трис-боратным буфером, содержащим 0.5 М NaCl с pH 8.35 (I = 0.075) со скоростью 10 мл/см2 x ч. Объединенные белковые фракции подвергали лиофильной сушке, запаивали в стеклянные ампулы (10 x 50 мм) и хранили в темноте при -40С.

Гидролиз БР.

4 мг белка помещали в стеклянные ампулы размером 10 x 50 мм, добавляли 5 мл 4 н. Ba(OH)2 и выдерживали 24 ч при 1100С. Реакционную смесь суспендировали в 5 мл горячей дистиллированной воды и нейтрализовали 2 н. H2SO4 до рН 7.0. Выпавший осадок сульфата бария отделяли центрифугированием (200 g, 10 мин), супернатант удаляли при 10 мм рт. ст.

N-Днс-производные аминокислот.

К 4 мг сухого гидролизата БR в 1 мл 2 M NaHCO3 (рН 9-10) порциями при перемешивании добавляли 25.6 мг Днс-хлорида в 2 мл ацетона. Реакционную смесь выдерживали 1 ч при перемешивании при 400С, подкисляли 2 н. HCl до рН 3 и экстрагировали этилацетатом (3 x 5 мл). Объединенный экстракт промывали дистиллированной водой до рН 7.0 (2 x 1 мл), сушили безводным сульфатом натрия, растворитель удаляли при 10 мм. рт. ст. Выход 15.3 мг (78%).

Метиловые эфиры N-Днс-производных аминокислот

. Для получения диазометана к 20 мл 40% КОН в 40 мл диэтилового эфира добавляли 3 г влажной N-нитрозометилмочевины и перемешивали 15-20 мин на водяной бане со льдом. После окончания газовыделения эфирный слой отделяли, промывали дистиллированной водой до рН 7.0, сушили безводным сульфатом натрия и использовали для обработки N-Днс-производных аминокислот. Выход 17.4 мг (69%).

L

-[2, 3, 4, 5, 6-2H5]фенилаланин.

40

г фенилаланина растворяли в 300 мл 85% 2Н2SО4 (в 2Н2О) и нагревали с обратным водяным холодильником при 50-600С при перемешивании 3 сут. По окончании реакционную смесь охлаждали, нейтрализовали 30% NH4OН до рН 5.5. Продукт экстрагировали этанолом. Выход 24 г (58.7%). Т пл. 271-273, [a]d25 4.47 (с 1-2, 5 М НСl). рKa 2.20 (СООН), 9.31 (NH2). Rf 0.6 (Г). УФ-спектр (0.1 М НCl): lmax нм (e М-1 см-1): 257.5 (e 195). 1Н-ЯМР: d 3.25 (2H, Hb), 4.4 (1H, Ha), 7.2-7.4 (0.07Н), УД 90 ат.% 2Н. Масс-спектр (M)+ m/z (I, %): 165 (34), метиловый эфир N-Dns-[2, 3, 4, 5, 6-2H5]фенилаланина: 417 (14), 418 (6).

L

-[3, 5-2H2]тирозин.

100 г тирозина растворяли в 150 мл 3 М 2Н2SO4. Реакционную смесь нагревали 2 сут при 40-500С с обратным водяным холодильником в токе азота. По окончании нейтрализовали 28% NH4OH до рН 4.5 и охлаждали 1 сут при 40С. Кристаллический продукт фильтровали, промывали 2Н2О и сушили при 10 мм рт ст. Выход 90 г (86.5%). Т пл. 316 - 317, [a]d25 10.0 (с 2, 5 М НСl). рKa 2.20 (СООН), 9.21 (NH2). Rf 0.45 (Г). УФ-спектр (0.1 М Нcl) lmax нм (e М-1 см-1): 223 (e 8200) и 274.5 (e 1340). 1Н-ЯМР: d 3.32 (2H), d 4.35 (1H), d 6.9 (1H), d 7.2 (2H), УД 96 ат.% 2Н. Масс-спектр (M)+ m/z (I, %): 181 (21), метиловый эфир N-Dns-[3, 5-H2]тирозина: 429 (15), 430 (5).

L

-[2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофан.

К

40 мл 100% 2Н2О добавляли при 40С и перемешивании 80 мл трифторуксусного ангидрида (0.5 моль) и выдерживали 2 ч при 40С, затем дробными порциями добавляли 25 г триптофана. Реакционную смесь выдерживали 3 сут в темноте при 220С, расстворитель удаляли при 10 мм рт., нейтрализовали 30% NH4OH до 5.9, охлаждали 1 сут при 40С. Кристаллический продукт фильтровали, промывали 2Н2О и сушили при 10 мм рт. ст. Выход 19 г (60.3%). Т пл. 283-285, [a]d25 2.8 (с 1-2, 1 М НСl). рKa 2.46 (СООН), 9.41 (NH2). Rf 0.5 (Г). УФ-спектр (0.1 М НCl) lmax нм (e М-1 см-1): 218 (e 33500), 278 нм (e 5550), 287.5 (e 4550). 1Н-ЯМР: d 3.4 (2H, Hb), 4.4 (1H, Ha), 7.3 (1H, He), 7.2-7.4 (0.1Н, In-Н), УД 98 ат.% 2Н. Масс-спектр (M)+ m/z (I, %): 204 (28), метиловый эфир N-Dns-[2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофана: 455 (9), 456 (11).

Страницы: 1 2 

Статьи и публикации:

Расчет водопотребления на ОРЗ
Бассейны ИЦА – 2. Объем одного бассейна 2,90 м3. Количество бассейнов, которое необходимо заготовить составляет 73 шт. Потребуется 211,70 м3. 2,90 х 73 = 211,70 м3 Аппарат для обесклеивания икры АОИ. Количество 3 шт. по 5 бачков в ка ...

Темпы весового роста
Весовые показатели особей в улове составили от 5,4 г (сеголетки) до 325 г (шестилетки). Средний вес сеголеток составил 6,2 г, двухлеток – 38,2 г, трёхлеток – 84,5 г, четырёхлеток – 142,8 г, пятилеток – 222,8 г, шестилеток – 312,5 г (табл ...

Специфическое увеличение скорости реакции
Соответствующим подбором ПАВ можно добиться такого же увеличения скорости, как при мицеллярном катализе. Этот эффект называют микроэмульсионным катализом. Влияние выбора ПАВ на выход реакции покажем на примере реакции между децил бромид ...

Разделы