Экспериментальная часть
Страница 1

Объектом исследования служил каротиноидсодержащий штамм экстремальных галофильных бактерий Halobacterium halobium ЕТ 1001, полученный Яном Раапом (Лейденский университет, Голландия). Штамм модифицирован селекцией отдельных колоний на твердой (2% агар) пептоновой среде с 4.3 М NaCl [20].

В работе использовали D,L-аминокислоты (Reanal, Венгрия), АМФ и УМФ (Sigma, США). Для синтеза производных аминокислот использовали N-диметиламинонафталин-5-сульфохлорид (Днс-хлорид) (Sigma, США) и диазометан, получаемый из N-нитрозометилмочевины (Merck, ФРГ). L-[2, 3, 4, 5, 6-2H5]фенилаланин (90 ат.% 2Н), L-[3, 5-H2]тирозин (96 ат.% 2Н) и L-[2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофан (98 ат.% 2Н) (способы получения указаны в работах [21, 22]) предоставлены к. х. н. А. Б. Пшеничниковой (МГАТХТ). Масс-спектры

метиловых эфиров N-Днс-производных аминокислот получали методом электронного удара на приборе Hitachi MB-80 A (Япония) при энергии ионизирующих электронов 70 эВ, ускоряющем напряжении 8 кВ и температуре катодного источника 180-2000С. Сканирование анализируемых образцов проводили при разрешении 7500 усл. ед., используя 10%-ную резкость изображения. Спектры 1Н-ЯМР

регистрировали в 2Н2О на приборе Bruckman WM-250 (ФРГ) с рабочей частотой 70 МГц, химические сдвиги протонов (d) приведены в миллионных долях по отношению к Ме4Si. УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре Beckman DU-6 (США) в диапазоне длин волн 200-750 нм. Центрифугирование осуществляли на центрифуге Т-24 (Германия) с охлаждением при -40С. Обращенно-фазовую ВЭЖХ проводили на жидкостном хроматографе Knauer (ФРГ), снабженным насосом Knauer, УФ-детектором UF-2563 и интегратором Shimadzy СR-3A (Япония), используя колонку 250 x 10 мм с неподвижной обращенной фазой сепарон С18 (Kova, Чехоcловакия); элюент: (А) - ацетонитрил : трифторуксусная кислота = 100 : 0.1 - 0.5, об.% и (В) - ацетонитрил = 100 об.%; скорость элюции - 1.5 мл/мин: от 0 до 20% В - 5 мин, от 20 до 100% В - 30 мин, 100% В - 5 мин, от 100 до 0% В - 2 мин, 0% В - 10 мин. ТСХ проводили на хроматографических пластинках с закрепленным слоем флуоресцентного носителя Silufol UV-254 (Kavalier, Чехословакия) в системе (Г): н-бутанол : уксусная кислота : вода = 12 : 3 : 5, об.%. Электрофорез проводили в 12.5% ПААГ с 0.1% ДДС-Na в соответствие с протоколом фирмы LKB (Швеция). Количественное определение содержания белка выполняли сканированием прокрашенного в растворе кумасси-голубой R-250 электрофоретического геля на лазерном денситометре Beckman CDS-200 (США). Бактериальный рост изучали по оптической плотности бактериальной суспензии, измеренной при 540 нм на спектрофотометре Beckman DU-6 (США). Процедура выделения БР проводилась с использованием светозащитной лампы, снабженной оранжевым светофильтром ОРЖ -1X (200 x 0.5 мм).

2Н-Меченый БР

(выход 8-10 мг с 1 грамма бактериальной биомассы) получали на синтетической среде, заменяя протонированные фенилаланин, тирозин и триптофан их дейтерированными аналогами - L-[2, 3, 4, 5, 6-2H5]фенилаланином, L-[3, 5-2H2]тирозином и L-[2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофаном (г/л): D,L-аланин - 0.43, L-аргинин - 0.4, D,L-аспарагиновая кислота - 0.45, L-цистеин - 0.05, L-глутаминовая кислота - 1.3, L-глицин - 0.06, D,L-гистидин - 0.3, DL-изолейцин - 0.44, L-лейцин - 0.8; L-лизин - 0.85, D,L-метионин - 0.37, DL-фенилаланин 0.26, L-пролин 0.05, D,L-серин 0.61, D,L-треонин 0.5, L-тирозин 0.2, D,L-триптофан 0.5, D,L-валин - 1.0; АМФ - 0.1, УМФ - 0.1, NaCl - 250, MgSO4 .7H2O - 20, KСl - 2, NH4Cl - 0.5, KNO3 - 0.1, KH2PO4 - 0.05, K2HPO4 - 0.05, Na+-цитрат - 0.5, MnSO4 .

2H2O - 3 x 10-4, CaCl2 .

6H2O - 0.065, ZnSO4 .

7H2O - 4 x 10-5, FeSO4 .

7H2O - 5 x 10-4, CuSO4 .

5H2O - 5 x 10-5, глицерин - 1.0; биотин - 1 x 10-4, фолиевая кислота - 1.5 x 10-4, витамин В12 - 2 x 10-5. Среду автоклавировали 30 мин при 0.5 ати, рН доводили 0.5 М КОН до 6.5-6.7. Синтез проводили в колбах Эрленмейера, вместимостью 500 мл (объем реакционной смеси 100 мл) 3-4 сут при 35-370С в условиях интенсивной аэрации на орбитальном шейкере Biorad 380-S (Венгрия) и освещении монохромными лампами ЛДС-40 (3 x 1.5 лк).

Выделение фракции пурпурных мембран (ПМ).

Биомассу (1 г) промывали дистиллированной водой и осаждали центрифугированием (1500 g, 20 мин). Осадок суспендировали в 100 мл дистиллированной воды и выдерживали 1 сут при 40С. Реакционную смесь центрифугировали (1500 g, 15 мин), осадок ресуспендировали в 20 мл дистиллированной воды и дезинтегрировали ультразвуком (22 кГц, 3 x 5 мин) в водяной бане со льдом (00С). Клеточный гомогенат после промывки дистиллированной водой суспендировали в 10 мл буфера 125 мМ NaCl, 20 мМ MgCl2, 4 мМ Трис-HCl, (рН 8.0), добавляли 5 мкг РНК-азы I (2-3 ед. акт.) и инкубировали 2 ч при 370С. Затем добавляли 10 мл того же буфера, выдерживали 14-16 ч при 40С. Водную фракцию отделяли центрифугированием (1500 g, 20 мин), осадок ПМ обрабатывали 50% этанолом (5 x 7 мл) при -50С с последующим отделением растворителя. Процедуру повторяли трижды до получения бесцветных промывных вод. Содержание белка определяли спектрофотометрически по соотношению D280/D568 (e280 1.1 x 105 и e568 6.3 x 104 M-1 см-1 [23]). Регенерацию ПМ проводили как описано в работе [24]. Выход фракции ПМ 120 мг (х. ч. 80-85%).

Страницы: 1 2

Статьи и публикации:

Легкие
Легкие - парный дыхательный орган. Они находятся в плевральных полостях и осуществляют газообмен между окружающей организм воздушной средой и кровью. Правое и левое легкое располагаются в грудной клетке. Каждое легкое окружено оболочкой ...

Близкодействие и дальнодействие, динамические и статические закономерности в природе
Дальнодействие и близкодействие– две противоречащие друг другу теории классической физики, появившиеся в начале её зарождения. Дальнодействие можно представит как мгновенное распространение гравитационных и электрических сил через пусто ...

Функциональная схема
Конструктивная схема операционного аппарата установки приведена на рисунке 2. Рисунок 2. Конструктивная схема операционного аппарата установки Операционный аппарат состоит из горизонтального ствола 1, установленного на вертикал ...

Разделы