Экспериментальная часть
Страница 1

Объектом исследования служил каротиноидсодержащий штамм экстремальных галофильных бактерий Halobacterium halobium ЕТ 1001, полученный Яном Раапом (Лейденский университет, Голландия). Штамм модифицирован селекцией отдельных колоний на твердой (2% агар) пептоновой среде с 4.3 М NaCl [20].

В работе использовали D,L-аминокислоты (Reanal, Венгрия), АМФ и УМФ (Sigma, США). Для синтеза производных аминокислот использовали N-диметиламинонафталин-5-сульфохлорид (Днс-хлорид) (Sigma, США) и диазометан, получаемый из N-нитрозометилмочевины (Merck, ФРГ). L-[2, 3, 4, 5, 6-2H5]фенилаланин (90 ат.% 2Н), L-[3, 5-H2]тирозин (96 ат.% 2Н) и L-[2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофан (98 ат.% 2Н) (способы получения указаны в работах [21, 22]) предоставлены к. х. н. А. Б. Пшеничниковой (МГАТХТ). Масс-спектры

метиловых эфиров N-Днс-производных аминокислот получали методом электронного удара на приборе Hitachi MB-80 A (Япония) при энергии ионизирующих электронов 70 эВ, ускоряющем напряжении 8 кВ и температуре катодного источника 180-2000С. Сканирование анализируемых образцов проводили при разрешении 7500 усл. ед., используя 10%-ную резкость изображения. Спектры 1Н-ЯМР

регистрировали в 2Н2О на приборе Bruckman WM-250 (ФРГ) с рабочей частотой 70 МГц, химические сдвиги протонов (d) приведены в миллионных долях по отношению к Ме4Si. УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре Beckman DU-6 (США) в диапазоне длин волн 200-750 нм. Центрифугирование осуществляли на центрифуге Т-24 (Германия) с охлаждением при -40С. Обращенно-фазовую ВЭЖХ проводили на жидкостном хроматографе Knauer (ФРГ), снабженным насосом Knauer, УФ-детектором UF-2563 и интегратором Shimadzy СR-3A (Япония), используя колонку 250 x 10 мм с неподвижной обращенной фазой сепарон С18 (Kova, Чехоcловакия); элюент: (А) - ацетонитрил : трифторуксусная кислота = 100 : 0.1 - 0.5, об.% и (В) - ацетонитрил = 100 об.%; скорость элюции - 1.5 мл/мин: от 0 до 20% В - 5 мин, от 20 до 100% В - 30 мин, 100% В - 5 мин, от 100 до 0% В - 2 мин, 0% В - 10 мин. ТСХ проводили на хроматографических пластинках с закрепленным слоем флуоресцентного носителя Silufol UV-254 (Kavalier, Чехословакия) в системе (Г): н-бутанол : уксусная кислота : вода = 12 : 3 : 5, об.%. Электрофорез проводили в 12.5% ПААГ с 0.1% ДДС-Na в соответствие с протоколом фирмы LKB (Швеция). Количественное определение содержания белка выполняли сканированием прокрашенного в растворе кумасси-голубой R-250 электрофоретического геля на лазерном денситометре Beckman CDS-200 (США). Бактериальный рост изучали по оптической плотности бактериальной суспензии, измеренной при 540 нм на спектрофотометре Beckman DU-6 (США). Процедура выделения БР проводилась с использованием светозащитной лампы, снабженной оранжевым светофильтром ОРЖ -1X (200 x 0.5 мм).

2Н-Меченый БР

(выход 8-10 мг с 1 грамма бактериальной биомассы) получали на синтетической среде, заменяя протонированные фенилаланин, тирозин и триптофан их дейтерированными аналогами - L-[2, 3, 4, 5, 6-2H5]фенилаланином, L-[3, 5-2H2]тирозином и L-[2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофаном (г/л): D,L-аланин - 0.43, L-аргинин - 0.4, D,L-аспарагиновая кислота - 0.45, L-цистеин - 0.05, L-глутаминовая кислота - 1.3, L-глицин - 0.06, D,L-гистидин - 0.3, DL-изолейцин - 0.44, L-лейцин - 0.8; L-лизин - 0.85, D,L-метионин - 0.37, DL-фенилаланин 0.26, L-пролин 0.05, D,L-серин 0.61, D,L-треонин 0.5, L-тирозин 0.2, D,L-триптофан 0.5, D,L-валин - 1.0; АМФ - 0.1, УМФ - 0.1, NaCl - 250, MgSO4 .7H2O - 20, KСl - 2, NH4Cl - 0.5, KNO3 - 0.1, KH2PO4 - 0.05, K2HPO4 - 0.05, Na+-цитрат - 0.5, MnSO4 .

2H2O - 3 x 10-4, CaCl2 .

6H2O - 0.065, ZnSO4 .

7H2O - 4 x 10-5, FeSO4 .

7H2O - 5 x 10-4, CuSO4 .

5H2O - 5 x 10-5, глицерин - 1.0; биотин - 1 x 10-4, фолиевая кислота - 1.5 x 10-4, витамин В12 - 2 x 10-5. Среду автоклавировали 30 мин при 0.5 ати, рН доводили 0.5 М КОН до 6.5-6.7. Синтез проводили в колбах Эрленмейера, вместимостью 500 мл (объем реакционной смеси 100 мл) 3-4 сут при 35-370С в условиях интенсивной аэрации на орбитальном шейкере Biorad 380-S (Венгрия) и освещении монохромными лампами ЛДС-40 (3 x 1.5 лк).

Выделение фракции пурпурных мембран (ПМ).

Биомассу (1 г) промывали дистиллированной водой и осаждали центрифугированием (1500 g, 20 мин). Осадок суспендировали в 100 мл дистиллированной воды и выдерживали 1 сут при 40С. Реакционную смесь центрифугировали (1500 g, 15 мин), осадок ресуспендировали в 20 мл дистиллированной воды и дезинтегрировали ультразвуком (22 кГц, 3 x 5 мин) в водяной бане со льдом (00С). Клеточный гомогенат после промывки дистиллированной водой суспендировали в 10 мл буфера 125 мМ NaCl, 20 мМ MgCl2, 4 мМ Трис-HCl, (рН 8.0), добавляли 5 мкг РНК-азы I (2-3 ед. акт.) и инкубировали 2 ч при 370С. Затем добавляли 10 мл того же буфера, выдерживали 14-16 ч при 40С. Водную фракцию отделяли центрифугированием (1500 g, 20 мин), осадок ПМ обрабатывали 50% этанолом (5 x 7 мл) при -50С с последующим отделением растворителя. Процедуру повторяли трижды до получения бесцветных промывных вод. Содержание белка определяли спектрофотометрически по соотношению D280/D568 (e280 1.1 x 105 и e568 6.3 x 104 M-1 см-1 [23]). Регенерацию ПМ проводили как описано в работе [24]. Выход фракции ПМ 120 мг (х. ч. 80-85%).

Страницы: 1 2

Статьи и публикации:

Значение микроэлементов
Изучение значения микроэлементов в обмене веществ растений необходимо для выявления новых возможностей управления их продуктивностью, поскольку микроэлементы могут выступать и как специфические и как неспецифические регуляторы обмена веще ...

Конверсия энергии солнца в технически удобные виды энергии и топлива с помощью биотехнологий
Если строго подходить к определению возобновляемых источников электроэнергии, то основным источником первичной энергии на Земле является Солнце, поскольку и движение атмосферного воздуха (ветер), и морские течения, и движение волн, и таян ...

Нос
Нос состоит из наружной части, которая формирует полость носа. Наружный нос включает корень, спинку, верхушку и крылья носа. Корень носа расположен в верхней части лица и отделен от лба переносьем. Боковые стороны носа по средней линии с ...

Разделы