Основными этапами исследования являлись: выращивание штамма экстремальных галофильных бактерий H. halobium на синтетической среде с [2, 3, 4, 5, 6-2Н5]фенилаланином (0.26 г/л), [3, 5-2H2]тирозином (0.2 г/л) и [2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофаном (0.5 г/л), выделение фракции пурпурных мембран (ПМ), отделение от низко- и высокомолекулярных примесей, клеточной РНК, каротиноидов и липидов, фракционирование солюбилизированного в 0.5% ДДС-Na белка метанолом, гель-проникающая хроматография на сефадексе G-200, электрофорез в 12.5% ПААГ с 0.1% ДДС-Na (рис.2). Поскольку белок локализуется в ПМ, освобождение от низкомолекулярных примесей и внутриклеточного содержимого достигали осмотическим шоком клеток дистиллированной водой на холоду после удаления 4.3 М NaCl и последующим разрушением клеточной оболочки ультразвуком при 22 кГц. Последующую обработку клеточного гомогената РНК-азой I (2-3 ед. акт.) проводили для разрушения клеточной РНК. Поскольку фракция ПМ наряду с искомым белком в комплексе с липидами и полисахаридами содержала примесь связанных каротиноидов и посторонних белков, применялись специальные методы фракционирования белка без повреждения его нативной структуры и диссоциации, что существенно усложняло задачу выделения индивидуального БР с применением методов декаротинизации и делипидизации, а также очистки и колоночной хроматографии. Декаротинизация, заключающаяся в многократной обработке ПМ 50% этанолом при -50С, являлась рутинным, но обязательным этапом, несмотря на значительные потери хромопротеина. Использовалось не менее пяти обработок 50% этанолом, чтобы получить спектр поглощения суспензии очищенных от каротиноидов (4) и (5) ПМ (степень хроматографической чистоты 80-85%), показанного на рис. 3 на различных стадиях обработки (б) и (в) относительно нативного БР (а). Образование ретинальпротеинового комплекса в молекуле БР приводит к батохромному сдвигу в спектре поглощения ПМ (рис. 3, в) - основная полоса (1) при максимуме поглощения l 568 нм, вызванная световой изомеризацией хромофора по С13=С14-кратной связи определяется наличием транс-ретинального остатка ретиналя БР568, дополнительная малоинтенсивная полоса (2) при l 412 нм характеризует незначительную примесь образующейся на свету спектральной формы M412 c депротонированной альдиминной связью между остатком транс-ретиналя и белком, а полоса (3) при l 280 нм определяется поглощением ароматических аминокислот в полипептидной цепи белка (для чистого БR соотношение D280/D568 равно 1.5:1). TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
Фракционирование и тщательная хроматографическая очистка белка являлись следующим необходимым этапом. Поскольку БР, будучи трансмембранным белком (Мr 26.7 кД), пронизывает билипидный слой в виде семи a-спиралей, применение сульфата аммония и других традиционных высаливающих агентов не дает положительного результата. Решение проблемы заключалось в переводе белка в растворимую форму солюбилизацией в 0.5% ДДС-Na. Использование ионного детергента ДДС-Na диктовалось необходимостью максимальной солюбилизации белка с комбинированием стадии делипидизации и осаждения в нативном виде, поскольку солюбилизированный в слабоконцентрированном растворе ДДС-Na (0.5%) БР, сохраняет спиральную a-конфигурацию [9]. Поэтому отпала необходимость использования органических растворителей ацетона, метанола и хлороформа для очистки от липидов, а делипидизация и осаждение белка совмещались в одну единственную стадию, существенно упрощающую фракционирование. Значительным преимуществом метода является, что целевой белок в комплексе с молекулами липидов и детергента распределяется в надосадочной жидкости, а другие высокомолекулярные примеси - в непрореагировавшем осадке, легко отделяемом центрифугированием. Фракционирование солюбилизованного в 0.5% ДДС-Na белка с его последующим выделением в кристаллическом виде достигали в три стадии дробным низкотемпературным (-50С) осаждением метанолом, уменьшая концентрацию детергента соответственно в 2.5 и 5 раза. Окончательная стадия очистки БР заключалась в отделении белка от низкомолекулярных примесей методом гель-проникающей хроматографии, для чего БР-содержащие фракции дважды пропускали через колонку с декстрановым сефадексом G-200, уравновешенную 0.09 М Трис-боратным буфером (рН 8.35) с 0.1% ДДС-Na и 2.5 мМ ЭТДА (рис.3). Согласно разработанному методу фракционирования получено 8-10 мг 2Н-меченого БР из 1 г бактериальной биомассы, гомогенность которого удовлетворяла требованиям, предъявляемым для реконструкции мембран и подтверждалась электрофорезом в 12.5% ПААГ с 0.1% ДДС-Na, регенерацией апомембран с транс-ретиналем и обращенно-фазовой ВЭЖХ метиловых эфиров N-Днс-аминокислот. Небольшой выход БР не был препятствием для последующего масс-спектрометрического анализа, однако здесь необходимо подчеркнуть, что для обеспечения высокого выхода белка необходимо наработать большее количество сырьевой биомассы.
Статьи и публикации:
Пшеница
Пшеницу человек возделывает более 10 тыс. лет. Но в разные эпохи люди выращивали разные виды пшеницы (всего род пшеница включает их около 20). Вспомним, например, "Сказку о попе и работнике его Балде" А. С. Пушкина. Нанимаясь на ...
Основные функции нервной клетки
Основными функциями нервной клетки является восприятие внешних раздражений (рецепторная функция), их переработка (интегративная функция) и передача нервных влияний на другие нейроны или различные рабочие органы (эффекторная функция)
Особ ...
Теория А. И. Опарина.
Первую научную теорию относительно происхождения живых организмов на Земле создал советский биохимик А. И. Опарин (г.р. 1894). В 1924 г. он опубликовал работы, в которых изложил представления о том, как могла возникнуть жизнь на Земле. Со ...