Биология » Ферменты » Эндонуклеазы рестрикции

Эндонуклеазы рестрикции
Страница 3

в. Различные группы рестриктирующих эндонуклеаз типа II

Большой каталог реактивов. У всех ферментов обнаружено около 90 разных сайтов узнавания. Каждый из ферментов получен из определенного прокариотического организма, что и отражено в его названии. Так, Eco RI ведет свое происхождение из штамма Escherichia coli К12; Hae II и HaeIII – из Haemophilus aegyptius; Bam HI – из Bacillus amyloliquefaciens штамма H; Mbo I и Mbo II – из Moraxella bovis и т.д. Два разных фермента, имеющие одинаковые сайты узнавания, называются изошизомерами. Однако изошизомеры не обязательно делают разрез в одном и том же месте; сравните, например, Xma I и Sma I.

Палиндромные сайты узнавания и разрезания. Эндонуклеаза Eco RI – одна из многих рестриктирующих эндонуклеаз типа II, которые узнают различные палиндромные нуклеотидные последовательности и делают разрезы, в результате чего образуются фрагменты с комплементарными одноцепочечными хвостами. В пределах этой группы можно выделить несколько разновидностей ферментов. Например, Eco RI, Hind III и некоторые другие эндонуклеазы узнают последовательности из шести пар оснований; эндонуклеаза Hinf I узнает пять пар оснований, из которых центральным остатком может быть любой из четырех нуклеотидов. Эднонуклеаза Bgl I узнает шесть специфических нуклеотидных остатков, но они должны быть разделены в середине любыми другими пятью парами оснований. Эндонуклеаза Not I имеет сайт узнавания протяженностью восемь пар оснований; такие ферменты, как Taq I и Mbo I, имеют сайты узнавания из четырех нуклеотидов. Другая известная особенность касается свойств одноцепочечных концов, образующихся при действии различных рестриктирующих эндонук-леаз. Эндонуклеазы Eco RI, Hind III, Mbo I и Оа I образуют одноцепочечные хвосты, состоящие из 5'-концевых остатков каждой цепи, а эндонуклеазы Pst I и Hae II – из 3'-остатков.

Эндонуклеазы, имеющие различные сайты узнавания и разрезания, часто образуют идентичные липкие концы. Например, под действием эндонуклеаз Mbo I, Bcl I и Bam HI образуются 5'-концевые 5'-GATC‑3'. В результате фрагменты, получающиеся при расщеплении данной ДНК любым из этих ферментов, при смешивании и отжиге будут соединяться друг с другом. Однако фрагменты, получающиеся из различных ДНК при разрезании эндонуклеазой Bgl I, вряд ли будут соединяться при отжиге, поскольку одноцепочечные хвосты могут содержать любую последовательность из трех нуклеотидов.

Другие рестриктирующие эндонуклеазы типа II также узнают специфические палиндромные нуклеотидные последовательности, но разрезают фосфодиэфирный мостик в середине узнаваемой последовательности, в результате чего образуются фрагменты ДНК с тупыми двухцепочечными концами.

Непалиндромные сайты узнавания с разрезанием на некотором расстоянии от них. Ферменты типа II, но другой разновидности тоже узнают специфические нуклеотидные последовательности, но гидролизуют фосфодиэфирные мостики вне этих последовательностей. При этом узнаваемая последовательность не является палиндромом. В этих случаях рестриктирующие эндонуклеазы, по-видимому, «отсчитывают» точное число пар оснований от узнаваемой последовательности и затем разрезают цепи. Механизм отсчета таков, что места гидролиза разных цепей смещены одно относительно другого на один нуклеотид. В результате образуются фрагменты ДНК с одноцепочечными выступами длиной только в один нуклеотидный остаток.

г. Картирование сегментов ДНК с помощью рестриктирующих эндонуклеаз типа II

С помощью рестриктирующих эндонуклеаз можно разрезать сложные геномы или длинные сегменты ДНК на воспроизводимые наборы более мелких единиц. В свою очередь такие единицы можно разделить по размерам с помощью нескольких методов. Чаще всего для этого используют электрофорез фрагментов ДНК в полужидком геле, приготовленном на основе агарозы или полиакриламида. Обычно подвижность двухцепочечного фрагмента в электрическом поле обратно пропорциональна логарифму его размера. Используя в качестве маркеров фрагменты известной длины, легко определить размер интересующего нас фрагмента с помощью линейки и простого графика. Для проведения такого анализа обычно достаточно менее 1 мкг ДНК, поскольку фрагменты легко выявляются при окрашивании соответствующим красителем, например бромистым этидием.

Страницы: 1 2 3 4

Статьи и публикации:

Замыкающие межклеточные контакты
Простое межклеточное соединение — сближение плазмолемм соседних клеток на расстояние 15—20 нм. При этом происходит взаимодействие слоев гликокаликса соседних клеток. Гликопротеиды соседних клеток при образовании простого контакта «узнают» ...

Продуценты
В качестве продуцентов протеолитических ферментов при глубинном культивировании в промышленных условиях используют бактерии в основном рода Bacillus, реже – актиномицеты и микроскопические грибы. Способность к образованию протеолитических ...

Территория и территориальное поведение
Территорией в биологии называют определённую зону, более или менее обширную в зависимости от размеров или образа жизни животного, контролируемую и охраняемую им (или ими). Территориальное поведение подразумевает способность создавать и ра ...

Разделы