Эволюция наделила различные виды бактерий уникальными эндонуклеазами, позволяющими им отличать их собственную ДНК от чужеродной. Тем самым природа снабдила ученых богатым набором высокоспецифичных реактивов для расщепления ДНК. При изучении ДНК большое значение имеют две важные особенности рестриктирующих эндонуклеаз. Первая связана с замечательной способностью фермента узнавать специфические короткие нуклеотидные последовательности в ДНК. Вторая состоит в том, что существует большое количество различных эндонуклеаз рестрикции, каждая из которых узнает специфическую последовательность. TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
а. Три типа эндонуклеаз рестрикции
Эндонуклеазы типов I и И. Ферменты, относящиеся к группе эндонуклеаз типов I и II, – это сложные белки, обладающие активностями рестриктирующей эндонуклеазы и метилазы. Эти интересные ферменты не используются, однако, при конструировании рекомбинантных молекул ДНК. Ферменты типа I связываются с ДНК в специфических участках и затем производят двухцепочечные разрезы на разном расстоянии от сайтов узнавания, варьирующем от 400 п.н. до 7 т.п.н. Для осуществления ферментативного гидролиза ДНК необходимы Mg2+, ATP и S‑аденозилметионин. Последний активирует фермент. Разрезание сопровождается гидролизом АТР, при этом фермент утрачивает эндонуклеолитическую активность, но сохраняет АТРазную. Таким образом, эндонуклеазы типа I являются ДНК-зависимыми АТРазами. Кроме того, они представляют собой сайтспецифические метилазы, катализирующие образование 6‑метиладениновых остатков в сайте узнавания. Например, сайтом узнавания для фермента из E. coli K12 является
5'-AACNNN NN N GTGC‑3' 3‑TTGNNNNNNCACG‑5'
где N – любое основание, a N‑комплементарное ему основание. Эндонуклеаза разрезает цепь на значительном расстоянии от сайта узнавания, но при этом метилирование с образованием 6‑метил-аденина происходит в пределах этого сайта. Эндонуклеазная активность проявляется только при наличии полностью неметилированного сайта. Сайт узнавания для фермента E. coli K12 состоит из двух коротких специфических олигонуклеотидов, разделенных шестью-восемью неспецифическими парами оснований. Такая структура типична для сайтов узнавания ферментов типа I, обнаруженных у различных штаммов бактерий. Специфические олигонуклеотидные последовательности для разных ферментов различаются, но метилированные остатки А всегда находятся в одинаковых позициях.
Родственные системы рестрикции-модификации типа I кодируются аллельными локулами геномов различных кишечных бактерий. С каждой системой связаны три сцепленных гена: hsdR, hsdM и hsdS, расположенные в порядке, соответствующем порядку транскрипции. Полипептидные продукты hsdM и hsdS транслируются с одной двухцистронной мРНК и вместе составляют метилазу. Первый из них обладает метилазной активностью, а второй осуществляет сайтспецифическое узнавание. Продукт гена hsdR обладает эндонуклеазной активностью. Все три полипептида содержатся в различных пропорциях в активных препаратах ферментов типа I.
Ферменты типа III, так же как и эндонуклеаза типа I, обладают нуклеазной и метилазной активностями. Однако, несмотря на то, что ферменты типа III активируются S‑аденозилметионином и для своей работы требуют АТР, они не катализируют ее гидролиза. Эндонуклеазы типа III делают двухцепочечные разрезы в ДНК на расстоянии примерно 25 п.н. от своих сайтов узнавания. В присутствии АТР и S‑аденозилметионина те же ферменты катализируют сайтспецифическое метилирование. Ферменты типа III‑гетеродимерные белки. Их субъединицы кодируются двумя сцепленными генами, локализованными у некоторых штаммов Е. coli во внехромосомных геномах. Каждый такой ген представляет собой отдельную транскрипционную единицу. Один генный продукт узнает специфическую последовательность и обладает метилазной активностью, другой выполняет эндонуклеазную функцию.
Поскольку ферменты типа I не разрезают молекулы ДНК на репродуцирующиеся фрагменты и эндонуклеазные активности ферментов типа I и III конкурируют с метилированием, ни один из них не используется в качестве реагента при получении рекомбинантных ДНК.
Статьи и публикации:
Распространение и биология вида
Русский осетр обитает в каспийском, черном и азовском море. Этот анадромный вид входит в реки, впадающие в указанные моря, для нереста. В каспийском бассейне важнейшая нерестовая река – Волга, однако вид мигрирует также в реку Урал (Казах ...
Принцип возрастания энтропии
Энтропия (греч. en в, внутрь + trope поворот, превращение) – одна из величин, характеризующих тепловое состояние тела или системы тел; мера внутренней неупорядоченности системы; при всех процессах, происходящих в замкнутой системе, энтроп ...
Смеси анионных и неионных ПАВ
Смеси анионных и неионных ПАВ находят широкое применение в технике, поскольку они обеспечивают надежную стабилизацию дисперсий, обусловливая при адсорбции на поверхности частиц и электростатическое, и стерическое отталкивание. Состав адсо ...