Биология » Ферменты » Эндонуклеазы рестрикции

Эндонуклеазы рестрикции
Страница 2

Эндонуклеазы типа II. Рестриктирующие эндонуклеазы типа II являются основным инструментом при конструировании рекомбинантных молекул ДНК и при анализе структуры ДНК. Эти ферменты способны узнавать специфические короткие нуклеотидные последовательности и связываться с ними, но в отличие от эндонуклеаз типов I и III они производят двухцепочечные разрезы по специфическим фосфодиэфирным связям либо в пределах самого сайта узнавания, либо на вполне определенном небольшом расстоянии от него. Один и тот же фермент разрезает данную молекулу ДНК с образованием одинаковых наборов фрагментов. Длина фрагментов определяется расстоянием между специфическими последовательностями, узнаваемыми этим ферментом. Ферменты типа II гидролизуют фосфодиэфирные связи между 3'-гидроксильной группой и фосфатом, в результате чего образуется 5'-фосфомоноэфирная группа с одной стороны от разрыва и 3'-гидроксильная группа – с другой.

Сайт узнавания и разрезания для рестриктирующей эндонуклеазы Eco RI. Разрезание происходит в два этапа: сначала гидролизуется одна цепь, потом – другая. При обычных условиях продуктами реакции являются два дуплексных фрагмента с комплементарными одноцепочечными концами. В условиях, способствующих стабилизации водородных связей между четырьмя нуклеотидами из разных цепей, фрагменты могут реассоциировать.

б. Типичная рестриктирующая эндонуклеаза типа II

Эндонуклеаза Eco RI. Широко используемая рестриктирующая эндонуклаза Eco RI разрезает ДНК в тех местах, где встречается последовательность 5'-GAATTC‑3'. Как и в случае других рестриктирующих эндонуклеаз типа II, эта последовательность является палиндромом, т.е. в обеих цепях точно напротив друг друга находятся одинаковые последовательности, читаемые в направлении 5'–>3'. Eco RI гидролизует фосфодиэфирные связи между остатками G и А в каждой цепи. Поскольку эндонуклеаза Eco RI разрезает обе цепи в том месте, где встречается палиндромная последовательность 5'-GAATTC‑3', молекула ДНК разрезается на характерный для нее набор фрагментов.

Липкие концы. Эндонуклеаза Eco RI производит ступенчатые двухцепочечные разрезы, при этом у образующихся фрагментов ДНК на концах образуются короткие комплементарные одноцепочечные хвосты из четырех оснований – 5'-ААТТ‑3'. В зависимости от ионной силы раствора и температуры эти комплементарные хвосты либо остаются спаренными, либо денатурируют, и тогда образуются отдельные фрагменты с короткими одноцепочечными выступами на 5'-концах. При соответствующих условиях комплементарные хвосты воссоединяются. Одноцепочечные концы, образующиеся при расщеплении ДНК эндонуклеазой Eco RI, получили название липких, поскольку они способны спариваться друг с другом. Важным следствием образования ступенчатых разрывов является то, что фрагменты, получающиеся в результате обработки эндонуклеазой Eco RI двух разных ДНК, могут соединяться с помощью липких концов. При этом различия, затрагивающие двухцепочечные спиральные сегменты указанных ДНК, на процесс соединения не влияют.

Фермент. В отличие от рестриктирующих эндонуклеаз типов I и III ферменты типа II, подобные Eco RI, не катализируют метилирования. Метилазную активность проявляет другой белок. Активная эндонуклеаза Eco RI представляет собой димер, состоящий из двух идентичных полипептидных цепей с мол. массой 31000. Исходя из гомодимерной структуры можно было бы ожидать, что фермент будет действовать симметрично на идентичные последовательности двух частей сайта узнавания и разрезать обе цепи одновременно. Однако на самом деле гидролиз происходит последовательно.

Белок взаимодействует с участком около десяти пар оснований; шесть из них находятся в пределах сайта узнавания, остальные являются фланкирующими. Именно эти фланкирующие последовательности, по-видимому, определяют выбор цепи, которая будет разрезана первой. Кроме того, фланкирующие пары оснований влияют на общую скорость разрезания в данном сайте узнавания, так что в разных сайтах одной молекулы ДНК гидролиз осуществляется с разной скоростью. Были получены кристаллы комплекса Eco RI и олигонуклеотида 5'-TCGCGAATTCGCG‑3' и проведен их рентгеноструктурный анализ. Это позволило в деталях выяснить способ взаимодействия данного фермента и ДНК. Было установлено, что между двумя остатками аргинина и одним глутаматом, с одной стороны, и парами оснований в сайте узнавания ‑ с другой, образуются водородные связи, в результате чего происходит частичное раскручивание В-ДНК. О свойствах других рестриктирующих эндонуклеаз типа II известно значительно меньше, но, по-видимому, они аналогичны свойствам Eco RI.

Страницы: 1 2 3 4

Статьи и публикации:

Теория Николая Коперника. Размышления, предшествующие открытию
Кафедральный собор Успения Богородицы во Фромборке, в котором служил отец Николай, - одна из главных святынь польского католичества. Собор был окружён крепкой стеной с оборонительными башнями и мог, если надо, служить крепостью. Коперник ...

Приложения
Приложение 1 Приложение 2 Приложение 3 Приложение 4 Приложение 5 Приложение 6 Клоп Вредная черепашка Пшеничный трипс Хлебный пилильщик Шведская муха Хлебный жук Злаковые тли Хлебная жужелица Пьявица ...

Отногенез, филогенез и реапитуляция
В «Зазеркалье» Белая Королева сообщает Алисе, что в иные дни она успевала поверить в целых шесть невозможных вещей еще до завтрака. Для современного читателя история развития представлений о связи между онтогенезом и эволюцией носит приме ...

Разделы